今天给大家介绍的是一篇来自cell reports的文章，阐释和分析了动物circular RNA生成过程中侧翼内含子序列特征。有助于我们对circRNA形成过程更深入理解。 正如该文作者所说“To investigate possible circRNA functions,it is important to understand circRNA biogenesis.”在理解circRNA生成机制的基础上可以更好地研究circRNA的功能。
研究者提出的问题是，除了内含子上ALU重复序列介导外显子环化外，成环外显子侧翼内含子序列是否还有其他典型特征或元件，并据此进行了序列分析和实验验证，发现在线虫中与线性RNA分子相比circRNA侧翼内含子上富集着反向互补配对序列（RCMs），并且在人的circRNA的侧翼内含子区发现同样特征元件。进一步研究发现这些内含子RCMs对circRNA生成非常关键，双链RNA编辑酶ADAR1参与该过程，敲低ADAR1后可显著特异性地上调circRNAs的表达，并支持内含子间的互补配对序列通过竞争性结合方式介导外显子环化模型。
RCMs和ADAR在circRNA形成过程中的分子机制假说图
2011年Hansen等研究发现circRNA-CDR1as可能充当了miRNA spong的角色，行使内源性抑制miRNAs的作用机制，当年在nature上发表，轰动一时，这几年miRNA研究热潮经久不衰，circRNA联系miRNA进行研究多少是一种思维惯性使然，本文作者提出了不同看法，认为circRNA可能在形成蛋白功能复合物，竞争性剪切和RNA结合蛋白富集等方面起作用。
一、建立预测分析模型
研究者首先选定模式生物线虫为研究对象进行研究，理由是线虫基因组注释清楚较详细，并且不富含重复序列，可更好地分析除脊椎动物外序列保守性。在前期研究中通过二代测序获得1000个左右的有注释的circRNAs。生物信息学分析发现这些circRNAs侧翼内含子序列富集反向重复序列（RCMs），据此研究者针对RCMs开发了一种circRNA预测模型，并通过H score进行评分，运用这种基于RCMs算法预测模型对人基因组序列进行分析也能成功预测circRNA的存在。
基于内含子序列分析预测circRNA分子
二、circRNA侧翼内含子RCMs序列的保守性分析
预测的circRNA侧翼内含子RCMs序列在人和鼠中保守
三、在HEK293细胞中实验验证预测的circRNAs
人的circRNA侧翼序列主要是含ALU元件，但假阳性不可避免，因为大量人circRNA并未被报道，主要基于HEK293细胞中高表达的mRNAs。进一步的实验验证circRNA侧翼RCMs对其形成机制阐明显得非常必要。
RNA酶R处理后divergent primers检测预测的circRNAs并分成低、中、高三组，随后进行sanger测序验证。结果证明了预测的circRNA准确性。
四、ADAR蛋白是否参与到circRNA形成过程中？
ADAR(Adenosine deaminases acting on RNA, ADARs)是一种高度保守的结合双链RNA蛋白酶，主要参与了RNA编辑，特别是将双链RNA中腺苷残基转化为肌酐的过程。
在HEK293细胞中RNAi干扰ADAR1和ADAR2基因。对照设置：不处理RNA；敲低APOBEC蛋白家族（可以结合mRNA但不结合双链RNA，可以编辑单链DNA和RNA不编辑双链RNA）
C图敲低ADAR基因后，circRNA表达水平增加；D图PCR和western blot验证ADAR敲低效果。
上图表示对circRNA上下游序列分析发现A-I模式RNA编辑优先定位在circRNA环化位点临近200-600nt处。
ADAR敲低后，与宿主mRNA相比，circRNA的表达水平出现了增高，说明抑制ADAR后，circRNA的表达水平上调，而宿主mRNA表达水平未受显著影响。
五、思路拓展
这篇论文的发现其实非常有意思，可以想象下，如果ADAR在生理状态下瞬时降低后，或许正是circRNAs大展拳脚发挥作用的时候。之前有研究显示如果胚胎干细胞中ADAR基因表达降低时，干细胞可以分化成神经元细胞。CircRNA是否参与干细胞分化过程？值得进一步深入研究。CircRNA的高稳定性跟人脑记忆力保持是否相关？另外有研究表明muscleblind可以促进和调控一组环状RNAs的生成，muscleblind功能缺陷已知可以引起一种叫做营养不良性肌强直的严重退行性疾病。这一疾病的特征是渐进性的肌肉萎缩和无力，是成年期开始发病的一种最常见的肌营养不良症形式。CircRNA可能与了解并最终治疗肌肉及大脑的退行性疾病具有强大的关联。
参考文献
Ivanov A, Memczak S, Wyler E, et al. Analysis of Intron Sequences Reveals Hallmarks of Circular RNA Biogenesis in Animals[J]. Cell Reports, 2015, 96(96):113-5.
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