蒋华良院士团队：药物-离子通道量-效关系统计热力学理论模型的建立及其应用

来源 | 朵朵花开淡墨香 编辑 | 化学加

药物-离子通道量-效关系统计热力学理论模型的建立及其应用

蒋华良1，白芳2，高召兵1

1中国科学院上海药物研究所

2美国Rice大学理论生物物理研究所

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引 言

Hill方程是描述药物浓度(剂量)与药效关系的数学方程，广泛应用于药理学和生命科学领域，用于拟合药效(生物效应)与药物(生物活性分子)浓度的依赖关系(量-效关系)1。然而，许多药物的量-效关系不能用Hill方程拟合2，主要原因为：(1)经典的Hill方程没有考虑配体结合位点间的协同效应，因而不能用于药物与多作用位点靶标相互作用数据的拟合；(2)经典的Hill方程虽然考虑了靶标的聚合效应，但没有考虑靶标聚合的协同效应。因此，在拟合药物与有聚合效应的靶标相互作用数据时会遇到困难。

近年来，为克服Hill方程的局限性，研究者已提出了一系列描述配体-受体作用的量-效理论模型3-6。然而，迄今为止，仍然没有准确表述配体-离子通道相互作用量-效关系的理论模型。基于此，我们采用了严格的统计力学模型Ising模型7-9，从配体(激动剂或抑制剂)与离子通道相互作用的微观机制出发，推导了能定量描述药物与离子通道相互作用量-效关系的热力学模型，并成功应用于钾离子通道KCNQ2亚型10与激动剂ztz24011的作用机制研究。相关研究结果发表在近期的Frontierd in Pharmacology (https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00150) 。

这一研究策略是药理学中Black-Leff 操作模型(Operational Model)的推广，自上世纪八十年代以来，药理学界很少有人采用这种策略—“即基于物理化学原理推导药物的量-效关系，继而研究药物的作用机制”—来研究药理学问题。为了再现Black-Leff 操作模型在药理学研究中的重要性，我们基于近期发表在Frontierd in Pharmacology 的文章，写了这篇科普文章。

1.1 Hill方程与定量药理学

1910年，英国生理学家Archibald Vivian Hill(1886-1977)，在研究氧气与血红蛋白(Hb)结合饱和度与氧气压力(浓度)平衡关系时，提出了第一个定量描述小分子诱导生物效应的药理学方程—Hill方程12,13。Hill方程提出之初共涉及到三个方程式(即式(1)~(3))，用以描述氧气压力(浓度)与血氧饱和度间的平衡关系14：

Hill认为，在溶液中多种盐份的作用下，血红蛋白分子会以各种不同的聚合状态形式共存。因此，溶液中就同时存在氧气与血红蛋白的多种平衡关系，这里Hbn代表n个血红蛋白分子的聚合体。

Hill提出的三个方程中，应用最为广泛、影响最为深远的是式(1)。

其中，y1为氧气与血红蛋白的结合的饱和度(结合率)，x为氧气分压(mmHg)，K为氧分子与血红蛋白的结合常数，α为经验参数。

Hill提出的第二个方程认为，溶液中血红蛋白仅存在Hb和Hb2两种形式，氧气与血红蛋白的平衡关系则为：

其中，y2和式(1)中y1的意义相同，x同样为氧气分压(mmHg)，λ为二聚血红蛋(Hb2)所占的比例，而(100-λ)为单体血红蛋白(Hb)所占的比例，K1与K2分别为氧分子与血红蛋白单体和二聚体的结合常数。

Hill方程的第三个方程是用来描述n种血红蛋白聚合体共存的广义平衡关系。

λr指血红蛋白Hbr聚合态所占的比例。

Hill方程提出100多年来得到了广泛的应用。1926年，药理学创始人之一、英国著名药理学家Alfred Joseph Clark(1885-1941)，首次将Hill方程引入药理学研究中，用以描述乙酰胆碱对肌肉细胞作用的量-效关系，并于1927年发表该研究成果15。这是药物作用定量表示的开始，也是现代药理学的开端。Hill方程起初是通过拟合血红蛋白与氧解离的实验数据而获得的经验公式，Hill本人并没有具体说明该公式的物理化学基础。受Langmuir对金属表面吸附等温线公式推导过程的启发16，Clark和美国药理学与生理学家Franklin C. Mclean，基于化学热力学和动力学原理，特别是质量作用定理(Law of Mass Action)，首次对Hill方程作出全面的诠释，将Hill方程与药物-受体相互作用的热力学平衡关系联系了起来，为药理学的发展奠定了重要的理论基础17。

Hill方程的应用非常广泛，涉及到很多药理过程，如药物与蛋白质的结合、药物对细胞的激动作用、甚至动物水平的药效-药物剂量关系等。1968年，Wagner基于受体占据理论，提出将Hill方程用于描述药物的量-效关系1。之后四十年中，研究者又发展了用以描述药物剂量、药物浓度和药效与时间之间复杂关系的数学模型，这样 Hill方程又被广泛应用于非线性、可饱和的药物浓度-药效关系的阐述与研究中18,19。但是需要指出的是，这些应用都基本局限于针对药效-药物剂量实验数据进行量-效曲线拟合。

1.2 统计力学Ising 模型简介

相变是指物质从一种相转变为另一种相的过程。对相变的研究是物理学和化学中一个重要研究领域。Ising模型是由Wilhelm Lenz于1920年提出，从微观的相互作用出发，来讨论铁磁相变的代表性统计热力学模型。1925年，Wilhelm Lenz的学生Ernst Ising 发表了一维Ising模型的严格数学解20。1936年，Peierls提出二维或三维的Ising模型存在着自发相变，并进行了论证，但未给出严格解。1944年，Onsager发表了旋子代数的新解法，并给出了二维Ising模型的严格解，这引起了人们对于Ising模型的高度关注，该工作也极大地推动了相变理论的发展，Onsager本人也因此获得1968年的诺贝尔化学奖21。由于三维Ising模型存在拓扑学结构问题，人们采用分子力场或其改进理论、高温级数展开、低温级数展开、重整化群理论和蒙特卡洛模拟等手段来尝试计算三维Ising模型的居里温度和临界指数22,23。但是，截至目前，仍然没有方法获得三维Ising模型的精确解。

Ising模型将金属原子简化为自旋子，并将每个自旋子放在由Na个格点和Nb个联结组成的晶格模型(Lattice Model)中，晶格模型可以是线性的(一维，1D)，也可以是平面的(二维，2D)或立体的(三维，3D)，每一个晶格中的自旋σi(i=1,2, ….,Na)存在两种可能的状态，即上旋和下旋，分别由+1和-1表示(σi=±1)，每个自旋子仅同它相邻的两个自旋子及外磁场有相互作用，系统的哈密顿量24可表示为：

其中，E为整数，且满足-Nb≤ E ≤Nb。于是，Ising模型的配分函数可写为：

式中，β=1/kBT，kB为玻尔兹曼常数，T为温度，上述配分函数的表达式也可写为：

求解获得配分函数Z(T)后，便可以获得体系的热力学参数，如自由能、熵和焓等。

1.3 离子通道

离子通道是细胞内调控离子(Na+、K+、Ca2+和Cl-等)跨细胞膜被动运输的孔洞型蛋白质，它们通过自身构象的关闭与开放过程(门控过程，Gate Process)来实现细胞膜两侧电流的被动传输25。目前发现的离子通道已有650余种，可以依据门控方式、转运离子类型以及门孔数目三种方式对这些离子通道分别进行分类。若按门控方式来分，离子通道则主要分为电压门控、配体门控和机械门控三种类型。本论文主要关注电压门控离子通道，以下对其予以简单的介绍。

电压门控离子通道广泛存在于人体中，是人体电信号传导的关键蛋白质，能引起可激活细胞的动作电位，在神经兴奋与传导、中枢神经系统的调控、心脏搏动、平滑肌蠕动和骨骼肌收缩等过程中均起重要作用。电压门控离子通道的功能缺陷会引发心脑血管疾病、神经精神疾病等重要疾病，因而是重要的药物靶点26。

图 1 电压门控离子通道结构示意图：a)钾离子(K+)通道跨膜亚基；b)电压门控离子通道整体结构组装示意图；c)电压离子通道卡通图

电压门控离子通道(包括钾离子通道、钙离子通道和钠离子通道等) 基本都由一个较大的成孔α-亚基单元和数个辅助性亚基单元组装而成，通道的开关受控于跨膜电压。这些电压型离子通道的α-亚基单元一般包含四个同源结构域(I~IV)，每个结构域由六个跨膜片段组成(S1-S6) 27(图1a)，从而共形成24个跨膜区(图1b)。钠离子通道与钙离子通道均仅包含一个四次重复α-亚基单元，而钾离子通道则是一个由四个同源α-亚基单元组装而成的四聚体(图1b)28。这些离子通道的α-亚基单元都在第五(S5)和第六(S6)跨膜区片段之间形成离子孔道(如图1a)。第四跨膜片段(S4)则常常因为含有碱性氨基酸残基而成为高度带电的电压感受器，通过感受细胞动作电位变化引起离子通道蛋白发生构象改变，致使离子通道闸门呈现开启、关闭或失活三种状态。四个α-亚基组装为功能性电压敏感离子通道，除了离子通透功能和闸门功能，α-亚基也含有离子通道激动剂或拮抗剂位点。因此，组装的离子通道同时具有四个激动剂或拮抗剂结合位点。

2

药物-离子通道相互作用热力学模型的建立

首先，我们建立药物（本文以激动剂为例）与离子通道作用的晶格模型，如图2。一般情况下，假设激动剂可以和1个、2个、3个或4个α-亚单元结合，这样便存在5种激动剂与离子通道作用的结合微观态(构型)(图2)。

图2 激动剂-离子通道作用的晶格模型

离子通道由半圆饼表示，绿色球代表空的结合位点，晶格中酒红色球表示离子通道周围环境中的激动剂，离子通道上酒红色球代表已被激动剂占据的离子通道结合位点

激动剂与钾离子通道的结合态用s表示，其中s=1为结合状态，s=0为非结合状态。 s1~s4分别表示1个、2个、3个和4个激动剂与离子通道结合的微观态，s0表示无配体结合的离子通道微观态，则整个体系共存在s0~s4五种微观态。用组合数学方法，可以计算出每个微观态的简并度，分别为1、4、6、4和1(见图3)。假设未结合激动剂的离子通道的能量为0，1个激动剂与离子通道结合时体系的能量为E，激动剂在溶液中的能量为Es，则激动剂与离子通道的结合能DE=E-Es；2个、3个和4个激动剂与受体同时结合时产生的协同效应能分别为J、K和M，则由式(8)可获得激动剂-钾离子通道亚基的结合常数KA，以及2个、3个和4个激动剂与离子通道同时结合时产生的协同效应系数γ、μ和ν：

其中，b=1/kBT，kB为玻尔兹曼常数，T为绝对温度。

根据Ising模型与晶格理论，激动剂与离子通道结合各微观态的总能量为：

其中，s1、s2、s3和s4分别代表s1~s4四个微观态。各微观态具体能量 (E1~E4)如图3所示。

图 3 激动剂与离子通道结合的作用构型、能级和简并度

离子通道由半圆饼表示，绿色球代表空的离子通道结合位点，酒红色球代表已被激动剂占据的离子通道结合位点

假设每个激动剂在溶液中的能量为Es，则可以根据式(7)、(10)和(11)推导获得微观态s0~s4的配分函数(Z0~Z4)，分别如式(12)~(16)：

其中，单个配体与离子通道结合的结合能ΔE=E-Es。

整个系统的总配分函数则为：

由上述配分函数，可以计算获得各个微观态所占的比例(p0~p4)，见式(18)~(22)。

设晶格模型的体积为V，则激动剂的浓度可以由式(23)表示：

其中[L]为激动剂浓度，而[Lo]为配体参考态浓度(本文设为1mol/L)。由式(8)和(23)，式(18)~(22)可重写为：

设体系电压为V时，1个、2个、3个和4个激动剂与离子通道结合产生的单通道电流分别为ai、bi、ci和di，离子通道总NR，假如体系的最大电流为Imax=NRi，细胞总电流则为：

即：

因此，激动剂激活离子通道的统计热力学模型可归纳为式(31)：

式(31)是激动剂激活离子通道电流增加活性(I/Imax)与激动剂浓度([L])之间量-效关系的理论公式，其中的四个参数KA、γ、μ和ν分别是激动剂-离子通道相互作用的亲和性与协同效应有关的变构系数，另四个参数a、b、c和d分别是1-4个激动剂与离子通道结合后因变构而对通道导电产生影响的系数。如果知道一个激动剂与某离子通道相互作用的这8个参数，即可构建该激动剂激活这一离子通道的量-效关系理论曲线，也可由式(24)~(28)计算离子通道不同状态(s0~s4)的几率随激动剂浓度变化的曲线，为激动剂作用机制研究提供参数。式(31)中的8个参数，可通过拟合激动剂激活离子通道的量-效关系实验结果获得，用于预测激动剂激活离子通道突变体的量-效曲线。

为验证上述热力学模型的正确性，我们设计了野生型与突变体离子通道共存的杂合型离子通道，采用上述类似方法，根据同一激动剂与杂合型离子通道作用的方式，推导热力学模型，再应用上述由拟合激动剂激活野生型离子通道量-效曲线获得的8个参数，预测激动剂激活杂合型离子通道的量-效曲线，并与实验曲线比较。所谓杂合型离子通道是指野生型亚基与突变型亚基的杂合成具有生理功能的离子通道。我们在建立理论模型和进行实验验证时，均设置野生型亚基与突变型亚基的比例为1:1。这样，离子通道的野生型与突变型亚基的杂合方式有五种，分别为纯野生型离子通道(WT)4；野生型:突变型=3:1杂合(WT)3(Mutant)1，野生型:突变型=2:2杂合(WT)2(Mutant)2，野生型:突变型=1:3杂合(WT)1(Mutant)3，以及纯突变型离子通道(Mutant)4(见图4)。

图4 野生型亚基与突变体亚基杂合型离子通道的杂合方式及其相应的微观态

离子通道由半圆饼表示，蓝色半圆饼代表野生型亚基，紫色半圆饼代表突变型亚基，绿色球代表激动剂结合位点，激动剂与突变体亚基没有结合

图5 两个激动剂与杂合型离子通道结合微观态的简并度计算示例

离子通道由半圆饼表示，蓝色半圆饼代表野生型亚基，紫色半圆饼代表突变型亚基，绿色球代表激动剂结合位点，激动剂与突变体亚基没有结合；绿色球代表空的离子通道结合位点，酒红色球代表已被激动剂占据的离子通道结合位点

如图4所示，野生型亚基与突变体亚基在细胞膜表面组装成杂合型离子通道时，有5种微观杂合状态，分别是(WT)4、(WT)3(Mutant)1、(WT)2(Mutant)2、(WT)1(Mutant)3和(Mutant)4，与激动剂-野生型离子通道结合类似(图3)，每个微观杂合状态有不同的简并度(微观状态数)，这5种微观杂合状态的简并度分别是1、4、6、4和1(图4)。假设可以找到一种突变，激动剂不与突变体离子通道结合，但不影响离子通道的生理功能，我们可以分别推导出1个、2个、3个和4个激动剂同时与上述杂合型离子通道微观杂合状态结合时的简并度(s1~s4)，分别是32、24、8和1。图5例举了2个激动剂与杂合型离子通道结合时简并度的计算方法。此外，由于上述5种微观杂合状态均存在不与激动剂结合的状态，所以不与激动剂结合的离子通道的微观态s0，应为16(1+4+6+4+1)。

基于上述杂合型离子通道微观态简并度和与激动剂作用方式的分析，应用推导激动剂激活野生型离子通道量-效关系热力学模型类似的方法，我们推导了描述激动剂激活杂合型离子通道量-效关系的热力学模型。0-4个激动剂与杂合型离子通道结合所占的比例(p0~p4)如式(32)~(36)所示：

其中，各参数的物理意义与野生型离子通道统计热力学模型中相应参数的定义相同(见式(24)~(26)，在此不再赘述。

同样，设体系电压为V时：1个、2个、3个和4个激动剂与离子通道结合产生的单通道电流分别为ai、bi、ci和di，离子通道总数为NR，假如体系的最大电流为Imax=NRi，则细胞总电流为：

即

因此，激动剂激活杂合型离子通道量-效关系的统计热力学模型可归纳为式(39)：

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热力学模型在KCNQ2激活机制研究中的应用

3.1 KCNQ2及其激动剂ztz240简介

KCNQ(Potassium Voltage-Gated Channel, KQT-Like Subfamily)为一种慢激活和慢去激活电压门控钾离子通道，在神经元兴奋性调控中起重要作用。目前已知的KCNQ离子通道亚家族共有5个成员，按其发现顺序依次命名为KCNQ1~5(即Kv7.1～7.5)。这些离子通道家族成员在体内的分布和生理功能不尽相同。KCNQ2和KCNQ3在脑部高表达，两者均被认为是M电流的分子基础25。M电流最初是在牛蛙交感神经细胞上分出的一类电压依赖性钾离子电流，这种电流可被蕈毒碱(Muscarine)强烈抑制，因而称其为M电流(IM)，因此，与之相关的离子通道便被称作M通道。M通道在调解神经细胞兴奋性方面发挥重要作用，研究发现，KCNQ2和KCNQ3基因突变或M通道功能失调与许多中枢性疾病的发生有关，如良性家族性新生儿惊厥症和癫痫等。KCNQ2和KCNQ3的激动剂可以有效地控制这类疾病，目前已有一些活性化合物报道。其中，ztz240就是通过高通量筛选发现的KCNQ2的强效激动剂29。我们应用分子模拟、定点突变和电生理技术，已经确定了ztz240与KCNQ2的结合位点，且证实ztz240对KCNQ2的F137A突变体敏感30，即ztz240不与KCNQ2的F137A突变体结合，但对F137A突变对通道电生理效应无影响，适合于构建本文提出的杂合型离子通道。因此，本节采用ztz240与KCNQ2作为模式激动剂和模式离子通道，验证我们上面提出的激动剂激活离子通道量-效关系热力学模型。

3.2 统计热力学模型拟合ztz240激活KCNQ2量-效关系实验曲线

我们将大鼠KCNQ2通道基因通过脂质体方法转染进入中华仓鼠卵母细胞(CHO，Chinese Hamster Oocytes)，细胞培养24小时后，通过全细胞电压钳方式记录表达的KCNQ2通道外向钾电流信号。随后检测激动剂ztz240作用于KCNQ2野生型和野生型-F137A杂合型通道的量-效数据(通道电流I/I0)，并用式(40)对I/I0进行归一化处理，获得归一化电流ΔI/ΔImax(表1)。

表1 ztz240激活WT KCNQ2和WT-F137A杂合型KCNQ2作用的浓度-响应实验数据与实验值相应的归一化数据以及热力学模型对ztz240激活杂合型离子通道的预测数据

我们应用Matlab(MathWorks, Ltd.)软件包中的拟合工具箱cftool，将归一化的量-效实验数据ΔI/ΔImax与本文发展的统计热力学模型(31)进行拟合，优化方法采用非线性最小二乘法，通过多次平行拟合计算31，获得稳定的量-效曲线(图6)，并由此获得热力学模型中的8个参数的具体数值：

拟合所得的量-效曲线与实验数据的误差平方和SSE (Sum of Squares due to Error)仅为0.002468，而相关性系数R2高达0.9974，表明热力学模型可准确描述ztz240激活野生型KCNQ2的量-效关系。此外，通过拟合所得量-效曲线，我们可以获得ztz240与野生型KCNQ2作用的解离常数KD (KD=1/KA)和半数有效激动浓度EC50 (ΔI/ΔImax为最大值一半时ztz240的浓度)，分别约为5.540μM和7.41μM。由我们热力学模型计算获得的ztz240的EC50值与文献报道的实验值(5.80μM)30非常接近，说明该统计热力学模型可以准确计算ztz240与KCNQ2的结合热力学性质。

图6 本文发展热力学模型式(31)对ztz240激活野生型 KCNQ2量-效实验结果(蓝色点)的拟合(蓝色曲线)以及热力学模型式(39)预测ztz240激活WT-F137A杂合型KCNQ2量-效关系理论曲线(红色曲线)和实验结果(红色点)

为研究ztz240与KCNQ2的具体作用机制，我们将获得的离子通道亚基间的协同效应系数γ、μ和ν分别代入式(8)(温度采用298K)，则可获得离子通道亚基间的协同效应能J、K和M，分别是-0.04427kcal/mol、-0.4693kcal/mol和2.475kcal/mol。基于离子通道亚基间的协同效应能，我们可以推断，当2个ztz240分子与KCNQ2同时结合时，通道亚基间产生非常微弱的负协同效应；当3个ztz240分子与KCNQ2同时结合时，通道亚基间的负协同效应增强；而当KCNQ2的四个亚基单元均被ztz240分子占据时，通道亚基单元间则产生很强的正协同效应(协同效应能达到2.475kcal/mol)。

3.3 ztz240激活杂合型KCNQ2量-效关系曲线的理论预测和实验验证

为验证本文设计的激动剂-混合型离子通道统计热力学模型，我们将用热力学模型式(31)拟合ztz240激活野生型KCNQ2量-效曲线获得的8个参数(KA、γ、μν、a、b、c和d)代入描述激动剂激活杂合型离子通道量-效关系的统计热力学模型式(39)中，获得了ztz240激活杂合型KCNQ2通道WT-F137A的量-效关系理论曲线，即图6中的红色曲线。同时，我们应用电生理方法测定了ztz240激活杂合型WT-F137A通道的实验数据(表1)。实验数据的离散点也显示在图6中(红色点)，由此可知，这些实验数据离散点分布在我们热力学模型预测的量-效关系理论曲线附近。进一步计算表明，实验量-效数据与理论预测值的误差平方和仅为0.0056，相关性系数高达0.9933，说明我们的统计热力学模型可以准确预测ztz240激活杂合型KCNQ2的量-效曲线，这充分说明了我们发展的激动剂激活离子通道的热力学模型能准确描述激动剂-离子通道的相互作用。

与ztz240激活野生型KCNQ2的量-效曲线相比(图6中蓝色曲线)，ztz240激活WT-F137A杂合型KCNQ2通道的量-效曲线是双S形曲线，以Log[ztz240]=5.4为分界点，低于该浓度，曲线左移，高于该浓度，曲线右移。这一现象与一般药物-靶标作用情况不同，一般情况下，药物与靶标突变体作用，量-效关系曲线要么全部左移(药效提高)，要么全部右移(药效降低)。我们提出的激动剂激活离子通道热力学模型可以解释这一现象，KA、γ、μ、ν、a、b、c和d等参数依次代入式(24)~(28)与式(32)~(36)中，可以获得ztz240与野生型和杂合型KCNQ2通道各个结合微观态比率(p0~p4，p0~p4)随ztz240浓度变化的曲线(图7)。显然，与经验规律相符，随着化合物ztz240的浓度逐渐增加，空离子通道所占比例( p0和p0)急剧下降，而结合四个ztz240分子的微观结合态的比例( p4和p4)逐渐增加。与上述两种结合微观态不同，只结合1个、2个或3个ztz240的微观结合态的比率均随着ztz240浓度的增加，呈现出先增后减的钟形曲线。其中，结合3个ztz240的微观结合态的比例在ztz240的整个测定浓度区间内一直保持着较低水平，这与该结合微观态中离子通道亚基间所存在的较为明显的负协同效应直接相关。另一个有趣的现象是，在整个测定浓度范围内，1个激动剂与杂合型离子通道结合的总几率(p~Log[ztz240]曲线下的面积)比与野生型离子通道结合的总几率高(见图7)，而低浓度时，激动剂与离子通道作用的方式可能是以1:1结合为主，这可能是低浓度时，量-效关系曲线左移的重要原因。其原因可能是，由于野生型和突变体亚基组合成离子通道时，通道的微观状态增加(图4)，这就增加了1个激动剂与离子通道结合的简并度，从与野生型通道结合的4个简并度增加到与杂合型通道结合的32个，从而增加了1个激动剂与突变体通道结合的几率(比较式(25)和(33))。相反在高浓度时，激动剂主要采用4:1的方式与离子通道结合，激动剂无论与野生型还是与杂合型通道结合，简并度均为1，比较式(28)和(36)知，激动剂与杂合型通道的几率比与野生型通道结合的几率明显降低，因而激动剂激活杂合型通道的量-效关系曲线在高浓度时右移。这样，我们从激动剂-离子通道的从微观作用机制和激动剂与离子通道各微观态相互用的数学几率等方面，对激动剂激活杂合型通道的量-效关系的双S型曲线作了较为合理的解释。

图7 ztz240与KCNQ2的不同微观态结合时的几率随ztz240浓度(Log[ztz240])变化曲线:a)ztz240与野生型KCNQ2的结合几率；b)ztz240与WT-F137A KCNQ2的结合几率

我们发展的统计热力学模型还可以用于研究激动剂与离子通道作用的敏感性。由式(41)可以计算与1个离子通道结合的平均激动剂数目<Nbound>，

其中Z为激动剂与离子通道结合的总配分函数，由式(17)计算，b=1/kBT，kB为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，DE是激动剂与离子通道的结合自由能。由总配分函数的对数对结合自由能求偏导数，可以获得更容易理解的表达式，即激动剂:离子通道=1:1~4:1作用方式所结合的激动剂分子数(i=1~4)与相应的结合几率(pi)乘积之和。由式(41)，我们计算了激动剂分别与野生型和杂合型KCNQ2结合的<Nbound>随ztz240浓度对数(Log[ztz240])变化的曲线(图8)，<Nbound>~ Log[ztz240]曲线的最大斜率代表激动剂与离子通道作用的敏感性。由图8知，野生型离子通道<Nbound>~ Log[ztz240]曲线的最大斜率比杂合型的大，说明激动剂ztz240对野生型KCNQ2敏感。这可以从离子通道的结合位点来解释，所有野生型通道均有4个结合位点(见图3)，而杂合型通道的结合位点为0~4个(见图4)，因此，激动剂对野生型离子通道结合敏感。

图8 ztz240分别与野生型KCNQ2和杂合型型KCNQ2结合时的平均结合分子数随ztz240浓度间对数变化曲线

3.4 我们发展的热力学模型与Hill方程的比较

为体现我们发展热力学模型的准确性和优势，我们也用Hill方程拟合了ztz240激活野生型KCNQ2杂合型KCNQ2的实验数据结果（见图9）。 Hill方程拟合ztz240激活野生型KCNQ2实验数据的SSE和R2分别为0.01803和0.9790，而我们所发展的热力学理论模型式(31)拟合实验数据的SSE和R2分别为0.002468与0.9974(图9a)，说明我们发展的热力学模型拟合结果比Hill方程精确。而且，Hill方程完全丧失了拟合ztz240激活杂合型KCNQ2的实验数据，给出的结果是S型曲线而非双S型曲线 (图9b)。这一结果说明我们发展的热力学模在研究激动剂激活离子通道机制方面优于Hill方程。我们可以从数学上证明我们发展的热力学模型比Hill方程优越。Hill方程常用形式为式(42)，

EC50 是ΔI/ΔImax为50%时激动剂的浓度，H是Hill系数，是经验值，[L]是激动剂的浓度。对式(42)求二阶倒数得：

式(43)=0时，方程仅有唯一一个解，即[L]= EC50，说明Hill方程表示的曲线仅有一个拐点，即Hill方程只能拟合S型曲线。然而，激动剂激活杂合型离子通道量-效关系曲线是双S型曲线，有两个拐点，Hill方程自然不能拟合这样的曲线。而我们发展的热力学模型式(31)和式(38)可表示为：

对式(44)求二阶倒数得：

其中，a’m和b’n可以用ai, bj,m and n表达，式(43)=0时，方程有多个解，说明我们的热力学模型可以拟合具有多个拐点的曲线，包括双S型曲线。

图 9 Hill方程和我们热力学模型拟合ztz240激活野生型KCNQ2和杂合型KCNQ2实验数据的结果比较

结 论

近年来，研究人员已提出了一系列描述配体-受体作用量-效的理论模型，并在此基础上改进Hill方程。然而，迄今为止，没有一个专门描述激动剂结合或抑制剂抑制离子通道量-效关系的理论模型，许多配体-离子通道相互作用及其生物效应不能用Hill方程描述。为解决这一问题，我们应用统计力学Ising模型，结合激动剂-离子通道的作用方式，推导了描述激动剂激活野生型离子通道和杂合型离子通道量-效关系的统计热力学理论模型，并将其成功应用于激动剂ztz240激活钾离子通道KCNQ2和杂合性钾离子通道WT-F137A量-效关系研究。通过热力学模型拟合ztz240激活野生型KCNQ2的量-效实验数，我们获得了准确的ztz240激动KCNQ2的量-效曲线(R2=0.9974)，并获得了ztz240-KCNQ2相互作用的一系列热力学参数，包括结合常数(KA)、2-4个激动剂同时结合KCNQ2亚基的协同效应系数(γ、μ和ν)和KCNQ2体系的不同结合微观态的单通道电流权重系数(a、b、c和d)等，为ztz240激活KCNQ2的作用机制研究提供了有用的参数。

进而，基于ztz240-野生型KCNQ2作用的热力学参数(KA、γ、μ和ν)和激活离子通道的电导参数(a、b、c和d)，我们准确预测ztz240激活杂合型KCNQ2离子通道的量-效曲线为双S 型曲线，结果得到了定点突变和电生理实验测试的验证，理论预测结果和实验结果的相关性高达(R2=0.9933)(表1和图6)。而Hill方程完全丧失了拟合这样双S 型曲线的能力，即使拟合ztz240激活野生型KCNQ2量-效关系的S型曲线，我们发展的热力学模型拟合的结果比Hill方程精确。最后，我们从数学上证明了Hill方程的局限性，而我们的模型可以拟合任何形式的曲线(见式(43)和(45))。

我们推导的热力学模型虽然是针对激动剂-离子通道相互作用，但所采用的研究策略和公式可以直接应用于其他配体与多结合位点靶标的相互作用。

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