中科院遗传所储成才课题组发表用于测定水稻幼苗硝酸盐吸收及转运活性实验方法

15N是一种稳定的非放射性元素，可利用GC/MS（Gas Chromatography/Mass Spectrometry）进行精确测定。植物中通常用15N 标记方法测定 N 元素吸收。利用15N-KNO3 处理植物，当植物吸收 15NO3 后，对不同植物组织取材、烘干并研磨，就可以测定不同组织15N 含量，用以计算 15NO3 含量，进而计算出植物地上和地下部分硝酸盐吸收活性及转运速率，并进一步确定硝酸盐净吸收及转运活性。这种方法在水稻和拟南芥中同样适用。

中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才课题组主要以水稻为研究材料，开展农作物营养高效吸收利用的分子机制解析研究，通过分子设计实现农作物品种的定向改良。2015年课题组克隆到一个编码硝酸盐转运蛋白基因 NRT1.1B/OsNPF6.5，该基因在籼稻和粳稻间呈现显著分化，即籼稻型 NRT1.1B 比粳稻型有更高的硝酸盐吸收效率。在该研究中，用 15N 标记的 15N-KNO3 处理水稻幼苗可用于检测硝酸盐的吸收活性及转运速率。相关的实验流程以 15N-nitrate Uptake Activity and Root-to-shoot Transport Assay in Rice 为题发表在 Bio-Protocol 杂志（https://bio-protocol.org/e1897）。

研究人员利用改良的木村营养液（modified Kimura B solution）培养水稻幼苗。主要改良是用 5 mM KNO3 作为唯一氮源，Ca(NO3)2 用等浓度 CaCl2 代替。如图1所示，把露白的水稻种子播种在剪去底部的96孔PCR板上，然后用灭菌水培养三天，等根伸长至3-5厘米时改用木村营养液培养幼苗，每天固定时间换一次营养液，两周左右即可进行 15N 吸收实验。

做吸收实验当天，先在固定时间换营养液，进行大约2小时的预处理。2小时后再换含有 5 mM 15N-KNO3 的木村营养液（其他组分不变，把原来的 KNO3 换成等浓度的 15N-KNO3）进行吸收实验。吸收3小时后分不同组织取材。

组织烘干并充分研磨后，即可进行 15N 含量测定。根据地上和地下部分的15N 含量可计算硝酸盐吸收活性及转运速率（表1, 2）。

表1. 根据原始数据计算15N的含量。

表2. 根据 15N 的含量测定硝酸盐吸收活性及转运速率。

需要注意的是，等根伸长到3-5厘米时再换营养液。预处理的作用是确保水稻幼苗在 15N-KNO3处理前有一个正常的生理状态。

15N 标记的硝酸盐已被用于许多植物的硝酸盐吸收活性及转运速率测定。本文旨在以水稻幼苗为例进行介绍。读者可以在 Bio-protocol 找到该方法完整的实验和数据计算流程。

参考文献：

1.Delhon, P., Gojon, A., Tillard, P. and Passama, L. (1995). Diurnal Regulation of No3- Uptake in Soybean Plants .1. Changes in No3- Influx, Efflux, and N Utilization in the Plant during the Day-Night Cycle. Journal of Experimental Botany 46(291): 1585-1594.

2.Hu, B., Wang, W., Ou, S. J., Tang, J. Y., Li, H., Che, R. H., Zhang, Z. H., Chai, X. Y., Wang, H. R., Wang, Y. Q., Liang, C. Z., Liu, L. C., Piao, Z. Z., Deng, Q. Y., Deng, K., Xu, C., Liang, Y., Zhang, L. H., Li, L. G. and Chu, C. C. (2015). Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies. Nature Genetics 47(7): 834-838.

3.Lin, S. H., Kuo, H. F., Canivenc, G., Lin, C. S., Lepetit, M., Hsu, P. K., Tillard, P., Lin, H. L., Wang, Y. Y., Tsai, C. B., Gojon, A. and Tsay, Y. F. (2008). Mutation of the Arabidopsis NRT1.5 Nitrate Transporter Causes Defective Root-to-Shoot Nitrate Transport. Plant Cell 20(9): 2514-2528.

储成才课题组(http://chulab.genetics.ac.cn/)主要从事水稻功能基因组及农作物品种的分子设计改良，在水稻源-库互作、氮肥的高效利用等分子机制及农作物品种的分子设计等理论及应用基础研究领域做出了一系列原创性成果。首次解析了籼粳稻间氮肥利用效率差异的分子基础，为新一代绿色超级稻及其它作物的高产设计育种提供了全新的思路。在Nature Genetics, Nature Plants, Nature Communications, Genome Research, PNAS, Plant Cell, Cell Res, Molecular Plant, Plant Physiology, Plant Journal等杂志发表论文120余篇，应邀在Trends in Plant Science, Nature Plants, Molecular Plant, Journal of Experimental Botany等杂志发表综述和评论，论文引用8000多次。申请专利40多项，其中国际专利8项，合作培育水稻品种5个，累计推广面积1500多万亩。