一文读懂小麦抗白粉病基因Pm21

小麦抗白粉病基因Pm21

1、Pm21基因材料的创制与应用现状

簇毛麦 (Dasypyrum villosum，2n = 14，VV) 是小麦的一个重要近缘种(图1)，具有许多重要的抗病性和优良农艺性状。簇毛麦对几乎所有白粉菌生理小种表现高抗或免疫，高抗叶锈和秆锈病，对全蚀病、眼斑病、黄花叶病等多种病害都具有抗性，并且还具有抗寒、耐旱、籽粒粗蛋白含量高、分蘖力强、密穗多花等优良性状，已成为小麦遗传改良的优良基因资源。1935年，Sando将簇毛麦与栽培二粒小麦杂交，获得了20粒种子，开创了簇毛麦远缘杂交的先河。1937年，Kostoff实现簇毛麦与普通小麦杂交，但难度相对较大。1953年，Sears和Hyde分别创制了一套完整的小麦-簇毛麦1V-7V附加系，论文以背靠背的形式发表在《American Journal of Botany》上(Sears1953；Hyde 1953)。后来，Lukaszewski也创制了一套附加系 (未发表；Qi et al. 2011)。

图1 簇毛麦Dasypyrum villosum

在将簇毛麦有益基因转移到小麦的研究中，我国科学家作出了重要的贡献。1986年，南京农业大学刘大均院士等利用硬粒小麦与来源于英国剑桥植物园的簇毛麦进行远缘杂交，人工合成了硬粒小麦-簇毛麦双二倍体 (刘大均等 1986)。并在此基础上获得全套小麦-簇毛麦异代换系和异附加系 (Liu et al. 1988)，其中的6V异附加系和代换系表现高抗白粉病 (董凤高等 1992)。为了在小麦育种中更好地利用这一抗病基因，又用扬麦5号或扬麦4号与6V代换系的杂交当代种子进行Co60γ射线处理，创制了普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系，对7个供试白粉病菌系均表现免疫或高抗，且农艺性状与扬麦5号相似 (齐莉莉等 1995)。陈佩度等进一步利用双端体和原位杂交分析，结合白粉病抗性的表型鉴定，确定了易位断点靠近着丝粒。这个来源于簇毛麦的抗白粉病新基因被正式命名为Pm21 (Chen et al. 1995)。

6VS/6AL易位系R089、R137和R149等育成后发放到了全国的小麦育种单位。由于携带Pm21基因的材料同时含有抗条锈病基因Yr26，深受育种家欢迎，被广泛用于小麦新品种的选育,在小麦白粉病和条锈病防治上发挥了重要作用。目前通过国家和省级品种审定携带Pm21基因小麦新品种有30多个，如南农9918、扬麦18、扬麦21、内麦9号等主要分布西南和长江中下游麦区，黄淮麦区的部分品种如石麦14、金禾9123和国麦301也含有该基因。曹廷杰等(2015)检测了908个参加河南省小麦预试的新品系，仅发现国麦301和石郑816两个品系含有Pm21，说明利用Pm21在黄淮小麦主产区育成的品种还较少。鉴于南京农业大学细胞所在簇毛麦种质资源创新和利用上的突出贡献，陈佩度教授等人荣获2012年国家技术发明二等奖等国家及省部级奖项。

中国农业科学院作物科学研究所陈孝课题组利用来源于前苏联的簇毛麦也创制了硬粒小麦-簇毛麦双二倍体和6D/6V代换系等。抗谱分析表明，6D/6V代换系对国内外87个白粉菌菌株达到高抗和免疫水平 (陈孝等 1997)。进而结合幼胚培养及花药培养获得了普通小麦-簇毛麦6VS/6DL易位系，携带抗白粉病基因PmV (李辉等 1999；Li et al. 2005)。但是6VS/6DL易位系在育种上应用较少，明确报道含有PmV的品种只有扬麦22 (Bie et al. 2015a；图2)。

图2 T6V#2S·6AL和T6V#4S·6DL的细胞遗传鉴定（Zhao et al. 2019）

国外研究者多侧重于远缘杂交中的遗传学和细胞学行为的研究，较少关注簇毛麦抗白粉病的特性。齐莉莉等 (Qi et al. 1998)发现，Hyde创制的附加系DA6V#2抗白粉病，而Sears创制的附加系DA6V#1感白粉病；根据刘成等 (Liu et al. 2011)报道，Lukaszewski创制的附加系DA6V#3也感白粉病。为了获得抗白粉病的6VS易位系，Lukaszewski和Cowger将簇毛麦TA 5075与携带ph1b的品系Pavon 76进行杂交和回交，从后代中筛选到了抗病的6VS/6AL易位系 (Lukaszewski & Cowger 2017)。

2011年，李桂萍等以不同地区的小麦主栽品种与6VS /6AL易位系杂交和连续回交4-7次的高代品系为材料，分析了6VS/6AL易位染色体的遗传效应，发现易位染色体对小麦品系的小穗数、穗粒数、穗粒重和产量等农艺性状没有表现出明显的不利影响，对穗长和千粒重还表现出一定的正向效应。最近，Zhao等(2019)利用扬麦18(6VS/6AL易位系，即T6V#2S·6AL)和扬麦22(6VS/6DL易位系，即T6V#4S·6DL)杂交构建高代RIL群体，比较分析了易位染色体6VS/6AL和6VS/6DL的遗传效应。结果显示，T6V#2S·6AL和T6V#4S·6DL传递率均低于正常值，但T6V#2S·6AL的传递率显著高于T6V#4S·6DL。T6V#2S·6AL易位染色体对粒重、株高、穗长、穗顶部结实率等有显著正向效应，但对每穗小穗数和小穗密度有显著负向效应。而T6V#4S·6DL对株高有显著正向效应，对每穗小穗数有显著负向效应，对其它农艺参数影响均不显著。

为了消除6VS染色体上潜在的连锁累赘，南京农业大学细胞所为代表的研究人员开展了大量6VS小片段易位系的创制工作。别同德等使用小麦-簇毛麦双二倍体、6V单体附加系和二体代换系等为材料进行花粉辐射，实现了多类型易位系的高通量创制，将易位系的诱导率从过去的不到5%提高到70%以上，并发展了双末端标记法(double-distal-markerstrategy)，利用6V染色体的2个末端标记6VL358和6VS381从辐照群体中高效筛选易位片段(图3；别同德等2007；Bie et al. 2007；Bie et al. 2015b)。2008年，陈升位等使用Co60γ射线处理整臂易位系成熟雌配子，也诱导出一批外源染色体小片段易位系，进而鉴定出两个小片段易位系NAU418和NAU419 (Chen等2013)。这些6VS小片段易位系在小麦抗白粉病育种中具有重要潜在应用价值。

图3 6V染色体片段结构变异创制（Bie et al. 2015b）

2、6VS分子标记的开发

最初6VS分子标记的开发是利用RAPD技术。齐莉莉等(Qi et al. 1996)最早获得一个6VS特异的RAPD标记OPH17-1900，可用于追踪Pm21基因。刘志勇等(1999)对OPH17扩增的多态性片段进行了克隆、测序和SCAR标记开发，获得了稳定性较好的SCAR标记SCAR1400和SCAR1265，后来在分子标记辅助育种中得到广泛应用(图4)。李辉等(2005)利用6D/6V代换系Pm930640开发了5个RAPD标记和1个RFLP标记，其中OPAL03750和RFLP标记可区分PmV和Pm21。王振英等(2009)也筛选到与Pm21连锁的1个RAPD标记和3个AFLP标记。亓晓蕾等(2010)获得了可检测Pm21的2个EST-SSR标记(Xcfe164和Xedm129)和1个STS标记(Xcinau188)。宋伟等(Song et al. 2009)利用一个EST-SSR标记Xcau127，建立了可同时追踪Pm21和Pm12两个抗白粉病基因的技术体系。

图4 小麦抗白粉病基因Pm21 SCAR标记

在小麦EST作图数据公布之后，研究者以定位于小麦第六同源群染色体短臂的EST序列开发了多个6VS 的EST-STS标记，如CINAU15 ~ CINAU18，CINAU88~CINAU91和6VS381等(王春梅等 2007；陈升位和陈佩度 2010；Bie et al. 2015b)。为了提高标记开发的阳性率，何华纲等借助麦类-二穗短柄草比较基因组学，应用Feltus等(2006)提出的分子标记开发策略CISP(conserved-intronscanning primer)，发展出基于内含子测序的CISP-IS(CISP combined with intron sequencing)策略，针对序列差异更大的内含子，系统地开发了两套6VS分子标记，一套用于小麦背景下6VS染色体片段的检测，另一套用于二倍体簇毛麦水平的遗传分析。采用CISP-IS策略开发分子标记不仅阳性率高，而且由于标记都是基因来源的，可方便比较基因组学作图分析(He et al. 2013; He et al. 2016；He et al. 2017)。

近年来高通量测序技术得到广泛应用，Li等(2017)利用转录组测序数据，发展了一系列前苏联簇毛麦来源的6VS/6DL易位系(携带PmV基因)的多态性分子标记，其中有3个标记能区分Pm21和PmV。

在追踪6VS染色质的分子标记中，还有两个功能标记应用较多。一个南京农业大学曹爱忠等根据Stpk-V基因(Cao et al. 2006; Cao et al.2011)开发的NAU/xibao15902(CINAU15)；另一个是别同德等(Bie et al. 2015a)根据Pm21基因启动子区域开发的MBH1，具有更高的分辨率和稳定性，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳时都能有效区分Pm21和PmV(图5)。

图5 Pm21基因功能标记MBH1（Bie et al. 2015a）

3、Pm21基因的定位

由于外源染色体6VS与小麦染色体不交换，所以利用6VS/6AL易位系无法实现Pm21基因的精细遗传定位。早在1998年，齐莉莉等尝试利用小麦-簇毛麦抗病附加系DA6V#2(Hyde1953)和感病附加系DA6V#1(Sears1953)构建遗传群体，但遗憾的是两条不同来源的6V染色体在小麦遗传背景中不能有效配对。她们随后又筛选了46份簇毛麦品系，但没有发现感白粉病簇毛麦。因此，无论在六倍体小麦，还是二倍体簇毛麦都很难对Pm21基因进行遗传定位。因而，染色体缺失作图和比较基因组学作图成为备选方案。

齐莉莉等(Qi et al. 1998)从小麦-簇毛麦附加系DA6V#2的后代中筛选到仍具白粉病抗性的6VS缺失系del6V#2S-1，后命名为del.6VS-1，外源染色体断点在短臂0.58处(FL0.58)。在陈升位等(2008)创制的6VS染色体结构变异材料中，del.6VS-2也涉及6VS缺失，断点在短臂0.45处(FL0.45)。由于del.6VS-1(FL0.58)抗白粉病，而del.6VS-2(FL0.45)感白粉病，因此，Pm21基因被定位于6VS染色体片段FL0.45-0.58(Cao et al. 2011)。

何华纲等(He et al. 2016)利用开发的成套6VS分子标记对上述两个6VS缺失系的外源染色体断点进行扫描分析，将携带Pm21基因的6VS染色体区段 FL0.45-0.58定位在分子标记6VS-03与6VS-23之间，该区域对应于二穗短柄草基因组1.06 Mb (含144个基因)和水稻基因组1.38 Mb (含223个基因)物理区间。后来朱姗颖等(Zhu et al. 2018)利用缺失系(del.6VS-1和del.6VS-2)和小片段易位系(NAU418和NAU419)进一步将Pm21基因定位在分子标记6VS-08.6与6VS-10.2之间，该区域对应于二穗短柄草基因组117.7 kb (含19个基因)和水稻基因组37.7 kb (含5个基因)区间，与遗传作图所揭示的Pm21位点基本相当。

为了探讨簇毛麦自然群体中是否存在感染小麦白粉病菌品系，何华纲等(He et al. 2017)从国内外收集引进了110份簇毛麦材料，在一叶期使用强毒性白粉病菌系Bgt YZ01进行人工接种鉴定，筛选到4份感白粉病簇毛麦(图6，DvSus-1 ~ DvSus-4)。进而利用抗、感簇毛麦品系构建了一个F2分离大群体(DvRes-1/DvSus-1)，发现抗、感分离比符合3:1。尽管存在明显的交换抑制，但从含有10636个单株的F2分离大群体中利用两侧标记6VS-00.1和Xcfe164进行多重PCR，筛选到64个标记间发生交换的重组单株。使用二倍体水平的成套分子标记对所有交换单株进行基因分型，将Pm21基因定位在一个0.01 cM的遗传区间，两侧标记为6VS-08.4b和6VS-10b。比较基因组分析表明，Pm21所在遗传区间对应于二穗短柄草基因组112.5 kb (含18个基因)和水稻基因组23.2 kb (含2个基因)物理区间，而且在该区域存在一个典型RGA抗病基因的位点。遗传分析表明，DvEXO70(6VS-08.8b)、DvPP2C(6VS-09b)和这个RGA位点与Pm21基因共分离(图7)。研究还发现，Cao等(2011)报道的Stpk-V基因并不在Pm21遗传位点，距Pm21还有0.07 cM的遗传距离。

图6 不同簇毛麦品系和6V附加系对白粉菌的反应(He et al. 2018b)

图7 Pm21基因的遗传图谱(He et al. 2017)

4、Pm21基因的克隆

由于簇毛麦6VS与小麦染色体不交换、不同来源的6V在小麦背景下难以交换、缺乏感白粉病簇毛麦等因素的限制，经典的图位克隆策略难以应用于Pm21基因的克隆，因而早期的研究多采用反向遗传学的研究策略，基于mRNA差异表达相关的各类技术从6VS/6AL易位系中克隆抗白粉病相关基因。研究者先后克隆了类甜蛋白基因、抗坏血酸过氧化物酶基因、谷胱甘肽还原酶基因、谷胱甘肽硫转移酶基因、CMPG1-V基因等，功能研究已证实其中一些基因对小麦白粉菌具有一定抗性(Chen et al. 2007；Zhu et al. 2015)，说明它们都是小麦抗白粉病防御反应中的功能基因，或者是Pm21介导的抗白粉病调控网络中的成员。但这些基因都不在Pm21基因所在的目标染色体区域。

曹爱忠等(Cao et al. 2011)利用大麦基因芯片研究小麦白粉菌诱导下簇毛麦基因的表达变化，进而克隆了一个编码丝氨酸-苏氨酸激酶的Stpk-V基因，该基因可定位于携带Pm21基因的6VS染色体片段FL0.45-0.58。功能研究表明，Stpk-V基因能通过过氧化氢积累引发过敏性坏死反应，转基因超表达Stpk-V可增强小麦对白粉菌的抗性，是Pm21基因介导的抗白粉病途径重要成员。但根据精细遗传作图和物理作图数据，Stpk-V基因并不在Pm21位点(He et al. 2017；Zhu et al. 2018)，另外从抗白粉病功能角度，Stpk-V转基因超表达对白粉菌的抗谱与Pm21基因也不完全一致(Xing et al. 2018)。

为了克隆Pm21基因，南京农业大学细胞所与英国The Sainsbury Laboratory和捷克Institute of Experimental Botany合作，采用新兴的抗病基因富集和第三代测序(RenSeq-PacBio)方法获得了一批抗病候选基因，进而利用染色体定位、基因沉默、瞬间表达和稳定遗传转化等技术，证实其中一个编码CC-NBS-LRR抗病蛋白的NLR1-V基因是Pm21基因(Xing et al. 2018)。

与此同时，江苏里下河农科院的别同德研究员课题组和江苏大学何华纲教授课题组合作在发现感白粉病簇毛麦的基础上，采用图位克隆和比较基因组学相结合的策略，根据精细遗传作图所揭示的抗病基因位点，利用常规PCR技术，克隆了3个与Pm21共分离的抗病基因，并组装出Pm21位点，进而利用转录分析、病毒诱导的基因沉默(VIGS)、大规模EMS诱变、转基因及抗谱分析，证实自身启动子控制DvRGA2表达的转基因小麦具有广谱抗性特征，从而确定DvRGA2就是Pm21基因(2018a)。

5、Pm21及同源基因的进化

何华纲等从63个抗病簇毛麦品系中克隆到了72条Pm21等位基因序列，其中38条为非冗余序列(包括Pm21)，DNA序列的一致性为91.7%–100%，编码蛋白质的一致性为86.5%–100%。多序列比对分析显示，在这些等位基因的编码区存在7个InDel，但对簇毛麦的白粉病抗性并未产生影响。针对PM21全长蛋白及不同结构域检测了非同义突变率/同义突变率比值(Ka/Ks)，仅发现LRR结构域内暴露的可溶性残基(通常认为这类残基参与抗病蛋白识别病原效应子)的Ka/Ks比值超过(4.02)，表明这些残基在进化中承受了多样化选择(diversifying selection)，该数据与小种专化抗性基因Pm3 (Ka/Ks = 3.4)类似(He et al. 2018a)。由此推测，尽管Pm21目前具有广谱抗性特征，但从进化角度看，其本质仍是小种专化抗性基因，存在被毒性小种攻克的风险。

同时，何华纲等对感白粉病簇毛麦中的Pm21非功能性等位基因进行测定，发现感病簇毛麦的非功能性等位基因Pm21-NF1(DvSus-1)、Pm21-NF2(DvSus-2和DvSus-3)和Pm21-NF3(DvSus-4)分别涉及1个点突变、1-bp缺失和1281-bp插入。在前人报道的感病小麦-簇毛麦附加系DA6V#1和DA6V#3中，Pm21非功能性等位基因的序列分别与Pm21-NF3、Pm21-NF2完全相同，这表明附加系DA6V#1和DA6V#3中的变异Pm21基因均来自供体簇毛麦。进而在簇毛麦自然群体中追踪Pm21非功能等位基因的起源，结果显示，除了目标位点的变异之外，非功能性等位基因Pm21-NF2、Pm21-NF3的序列分别与功能性等位基因Pm21-F2(GRA961)、Pm21-F3(GRA1114)完全相同。由此推测，非功能性等位基因Pm21-NF2、Pm21-NF3分别起源于抗白粉病簇毛麦品系GRA961和GRA1114。非功能性等位基因Pm21-NF1的起源尚不明确(He et al. 2018b)。

在已克隆的小麦抗病基因中，Pm21基因与抗秆锈基因Sr22所编码的蛋白质的氨基酸序列一致性最高，但也仅为35%，而与抗白粉病基因Pm2、Pm3b、Pm8的编码蛋白的序列一致性低于20%，可见Pm21基因在序列上具有独特性。利用现有公布数据进行BLAST分析，发现Pm21直系同源基因广泛存在于普通小麦及其亲缘物种中，如栽培一粒小麦、野生二粒小麦、硬粒小麦、乌拉尔图小麦、节节麦、拟斯卑尔脱山羊草等，表明Pm21基因是一类比较古老的抗病基因。不过，在这些物种中，Pm21基因的结构通常在第二内含子处被反转座子打断，从而丧失抗病功能(图8, He et al. 2018a)。为了发掘潜在的功能性同源基因，以强毒性白粉病菌系Bgt YZ01对一些小麦野生近缘和远缘物种进行了接种鉴定，对部分具良好抗性(反应型0或0;)的材料进行RT-PCR分析，检测Pm21直系同源基因的表达情况。随后从四倍体簇毛麦、拟斯卑尔脱山羊草、沙融山羊草、西尔斯山羊草、黑麦、大麦等多个物种的部分品系中克隆到能组成型表达并编码Pm21直系同源基因的全长抗病蛋白，推测这些基因可能具有白粉病抗性，相关验证工作正在进行中(何华纲等未发表数据)。

图8 Pm21同源基因在小麦族中的进化(He et al. 2018a)

6、Pm21基因的人工进化与未来

利用Pm21基因育成的在黄淮小麦主产区大面积推广的品种还较少，推测其中的原因之一可能是6VS整臂易位带来的连锁累赘。最近的研究证实，6VS易位染色体会显著降低穗数和小穗密度，限制产量；另外，6VS易位染色体还会增加株高，导致材料容易倒伏(Zhao et al. 2019)。创制和使用小片段易位系是克服连锁累赘的重要途径之一。陈佩度教授团队目前已经获得了多个小片段易位系(Chen et al. 2013)，但它们的补偿性和价值还有待于在育种中广泛利用加以评价，期待在未来的几年中能尽快育成主栽品种。在克隆Pm21基因的基础上，对Pm21基因进行转基因育种可以克服连锁累赘问题。然而在当前转基因育种的管理政策下，还需探索其他途径。如发掘对小麦农艺性状具有不同影响的6VS易位系，进而利用6VS染色体之间的重组，对农艺性状进行优化组合，创制出具有更高育种价值的优异种质(Zhao et al. 2019)。另外，在筛选扬麦18的感白粉病突变体过程中，也获得了多个抗病的矮秆突变体(何华纲等未发表数据)，因此可采用传统的诱变育种策略消除连锁累赘，包括降低株高和增加穗数等，进一步提升Pm21基因的育种价值。随着基因编辑技术的发展，未来有望将完整的Pm21基因定点插入到小麦基因组中，创制高产和抗病的小麦新品系。

自从Pm21基因被克隆以来，还需要思考一个问题：Pm21基因的广谱抗性能否持久？首先，从等位基因的进化角度看，Pm21基因编码典型的CC-NBS-LRR蛋白，与小种专化抗性基因Pm3类似，其LRR内暴露的可溶性残基也承受了多样化选择压。其次，从大规模突变研究来看，单碱基的变异容易导致Pm21丧失功能，而且，经白粉菌小种鉴定发现，部分LRR变异的突变体改变了小种识别特异性(何华纲等未发表数据)。由此推测，如果在生产上单一化大面积使用，Pm21基因可能存在丧失抗性的风险。因此，育种工作者应当合理布局，避免单一化使用Pm21基因，有意识地保护Pm21这类优异抗病基因。对研究者而言，或可从技术层面进行Pm21基因的人工进化研究，创制具有持久抗性的Pm21新等位基因。通过Pm21基因饱和突变体库的构建，已经筛选到许多抗性表型削弱或完全感病的突变体，对部分突变体进行全生育观察发现一些突变体在苗期高感白粉病，到成株期又能部分或完全恢复抗性，经多点鉴定，个别突变体具有稳定的成株期抗性(何华纲等未发表数据)。由此可见，可通过人工诱变改变一个基因的抗性，采用人工进化策略或许可以创制出具有持久抗性的新种质。

目前，对Pm21基因的抗性机理还知之甚少，随着Pm21基因介导的抗病遗传和分子网络解析及其突变体的结构-功能关系研究的深入，有望能更加深入地理解Pm21基因的遗传和分子特性，为利用其进行持久抗性育种奠定理论基础。

注：该文经授权转载自微信公众号“小麦基因组与遗传育种”。作者为江苏大学何华纲和中科院遗传所刘志勇。因篇幅有限，参考文献请查看原公众号。