Nature Cell Biology | 相分离可调控DNA损伤修复

撰文 | QY
责编 | 兮

真核生物的基因组 DNA 在细胞核中被高度折叠和有序组织【1】。细胞内的基因组DNA时刻受到来自细胞外（如紫外、电离辐射、放射性物质等因素）以及内源性（活性氧等）的DNA损伤因素的诱导发生DNA损伤。各种因素所诱导的DNA损伤如果不能在正确的时间被精确的修复，将导致细胞基因组的不稳定性，导致细胞的基因突变，癌症等疾病的发生发展。细胞为了维护其基因组稳定性，在长期的进化过程中，进化出了一套完整的，被精细调控的DNA损伤修复机制，来确保基因组在受到损伤后仍然能够被完整地修复，保持遗传物质的相对稳定性。DNA损伤修复主要分为三个阶段，首先被细胞内的一些DNA damage sensor protein（如MRN complex等）所感知，这些蛋白募集到DNA损伤位点。这些蛋白在DNA损伤位点的聚集，将进一步招募下游的Signal Transducer（如ATR，ATM， CHK1等），将DNA损伤修复信号放大，并激活最终的Effector（如p53），从而实现对细胞周期的阻滞，并通过NHEJ，HR等DNA修复途径修复损伤的DNA，如持续的DNA损伤存在不能被修复，细胞将走向凋亡，从而维护整个细胞群体中基因组的稳定性【2】。在长期的DNA损伤修复机制的探索过程中，相关的精细的分子调控机制被逐渐阐明。但是这一领域大家都所熟知DNA Damage Foci具体是如何形成，其物理化学本质仍不清楚。对于如此多的DNA损伤修复蛋白，是如何在DNA损伤修复位点被精确地在时间和空间上所调控、所协调的具体机制目前仍不明确。

前期的探索过程中发现，PARP1可以在Laser micro-irradiation诱导DSB后，1秒的时间内聚集到DNA损伤位点，是非常早期的DNA damage sensing protein，早于MRN complex，当时PARP1被抑制后，MRN的募集到相关位点被显著抑制【3】。有文章报道，DNA damage 将激活PARP1，促进PAR chain 的合成，并诱导FUS/TLS, EWS, TAF15 等蛋白在DNA损伤位点发生相分离现象【4,5】。这种形成的相分离对于DNA损伤修复相关蛋白具有一定的选择性，会募集MDC1蛋白但是会排斥53BP1蛋白。也就是说，早期的DNA sensing后可能诱导了一些早期募集过来的DNA损伤修复相关蛋白发生相分离现象，进一步Concentrate这些相关的蛋白以快速有序地启动精细的DNA损伤修复反应，提示了PAP修饰可能作为诱导DDR蛋白发生相分离的一种“导火索”。最近发表在The EMBO Journal的题为Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments的文章，通过一系列精细的体内，包括optoDroplet等实验证实了53BP1会在DNA损伤的时候发生相分离的现象【6】，该文章在体外使用了纯化的53BP1的C末端蛋白，在有Molecular crowder的条件下能够发生相分离现象，但是具体发生相分离的一个所谓的“导火索”仍不明确，也未在体外较好的重构出相关的现象。

来自意大利的Fabrizio d’Adda di Fagagna课题组长期致力于DNA损伤修复领域的研究（课题组网址：https://www.ifom.eu/en/cancer-research/research-labs/research-lab-daddadifagagna.php），在该领域发表了一系列重要的文章，于2012年在Nature杂志，2017年在Nature Cell Biology发表文章，阐明了DNA 损伤可以诱导DNA损伤位点合成RNA，并参与了DNA Damage Response (DDR) 蛋白的募集，调控了DNA损伤修复过程【7,8】。

2019年9月30日，该课题组在Nature Cell Biology上发表了题为Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors的文章，报道了在DNA损伤修复位点产生的RNA可以作为“导火索”促进53BP1的相分离，从而调控DNA损伤修复过程。

课题组前期的研究发现，DNA双链断裂可以募集RNA polymerase II，从而合成Damage-induced long non-coding (dilncRNA)，并且这种dilncRNA对于DNA损伤修复通路的激活，以及DDR protein的招募起着至关重要的作用，但是dilncRNA是如何将这些蛋白招募到相应位点的具体的分子机制仍不明确。

这篇文章中，作者首先通过ChIP-PCR、免疫荧光、超分辨成像、DI-PLA等技术手段，证实了不仅是RNA polymerase II可以定位到DNA 损伤位点，作者还证实了其他的Preinitiation complex的组分，比如：TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF以及PIC相关的蛋白比如：MED1，CDK9在细胞基因组发生双链断裂的时候会富集到断裂的位点形成有功能的转录起始复合物，起始dilncRNA的生成。同时作者发现，这种PIC复合物的募集是依赖于DNA双链断裂传统的Sensor protein complex-MRN complex。当敲低MRN组分的时候这种PIC复合物的募集显著降低，同时dilncRNA的合成也明显降低。作者进一步通过体内以及精细设计的，多种方式验证的体外实验证实了dilncRNA对于DNA damage response信号通路的激活是非常重要的，无论是敲低PIC组分，小分子药物抑制PIC复合物功能，或者RNA酶的处理，都会显著影响DNA损伤修复信号通路的激活。

有趣的是，作者结合前期的实验结果，通过免疫荧光以及体外的Pull-down实验模拟细胞内DNA双链断裂过程，发现dilncRNA能够显著地促进DNA damage response 相关蛋白聚集到DNA损伤修复位点。因此，这可能是dilncRNA调控DNA损伤修复过程的重要的分子机制。但是dilncRNA是如何调控这些蛋白的聚集？结合近年来的研究成果，RNA可以诱导一些蛋白发生相分离，从而调控蛋白相应的生理功能，作者猜测，是否这种dilncRNA作为“导火索”促发了一些DDR 蛋白的相分离，从而募集这些蛋白到DNA损伤位点，完成DNA损伤修复过程？

作者选取了经典的DDR 蛋白53BP1，通过序列分析显示，53BP1有一段长的IDR区域，并且有大量的serine residues and charged regions。提示了53BP1可能会发生相分离。作者在细胞内发现，在DNA损伤发生时候GFP-53BP1会显著地聚集到DNA损伤位点，形成明亮的foci，作者使用FRAP实验，证实了这种Foci缺失能够在荧光漂白后迅速地恢复，提示了Foci内蛋白的流动性。并且这种Foci对于1，6己二醇以及NH4OAc 是敏感的，说明了该Foci缺失具有liquid的性质，作者进一步的实验发现，这种foci会随着DNA damage时间的延长，会逐渐变大，而且两两之间可能会发生融合，高度提示了该Foci具有液滴的性质，另外，作者还通过了一系列的实验证实了这些foci的表面张力，粘稠度等物理化学参数，从多种角度证实了该Foci缺失时相分离形成。作者进一步探索dilncRNA对53BP1的相分离现象的影响，作者发现，当抑制dilncRNA的生成后，53BP1的foci仍然能够形成，但是这种foci却不能“长大”也极少发生两两之间的融合。也就是说dilncRNA对于53BP1的Nucleation 并不影响，缺调控了其Growth以及Coarsening 过程。

在这篇文章的体外的实验中，作者没有使用的经典的体外相分离实验所常用的纯化的蛋白、纯化的RNA以及明确的Buffer体系，而是用的nuclear extracts from cells expressing 53BP1–GFP加上作者实验室前期的体外的DNA damage response的体系。作者的体外实验发现，dilncRNA确实能够诱导53BP1的相分离。但是从作者的体外的data来看，似乎dilncRNA对于53BP1的相分离的调空是影响了53BP1的Nucleation过程，与作者的体内的实验结论并不一致。另外，从作者的体外的相分离实验的数据的Figure来看，体外的相分离实验的结果并不完善。或许如果能应用纯化的53BP1蛋白，纯化的RNA，以及DNA组分，能重塑出相分离现象，可能说服力会更强，也更能明确的说明dilncRNA对于相分离的影响。

作者接着证实了这种相分离确实是调控了DNA damage response过程，但是这一实验结果的数据量较少。

总的来说，该文章发现了DNA 损伤诱导生成的RNA能够通过调控53BP1的相分离，从而调控DNA损伤修复相关蛋白的在DNA损伤修复位点的聚集。为DNA损伤修复的研究提供的新的思路。

结合最近发表的这两篇文章，用The EMBO Journal的Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments这篇文章配发的评论文章53BP1-DNA repair enters a new liquid phase来总结这几篇文章的工作是最为合适的。但是结合另外的几篇文章【4-6】以及本月13号由Karim Mekhail实验室post到预印本bioRxiv上的题为DNA repair by Rad52 liquid droplets的文章，可以说DNA damage foci enters a new “ phase”或者说DNA Damage Research enters a new “Phase”。

或许相分离能够从全新的角度阐明整个DNA 损伤修复过程的各种蛋白之间的精细的协调工作过程。或许相分离也能够解释之前的研究结果：细胞内的DNA damage response过程的激活并不需要细胞内DNA damage的真实发生，而只需要将MRE11，NBS1，MDC1，ATM等能够在DNA damage过程中形成“Foci”的蛋白Target到chromatin上并形成Foci，就可以激活DNA损伤修复过程, 而将DNA损伤修复下游的整个DNA损伤修复过程中并不形成Foci的蛋白比如CHK1，CHK2 target到Chromatin上，并不能启动细胞的DNA损伤修复信号通路【9】。另外，ATR 等下游蛋白是如何被招募到DNA损伤位点，是否能够选择性地进入不同的Foci 从而在DNA damage 位点发挥作用? 这些蛋白又如何在 DNA 损伤修复完成后离开此位点?都是尚未解决的问题。

制版人：珂

参考文献

1.Olins DE, Olins AL. Chromatin history: our view from the bridge.Nature reviews Molecular cell biology2003;4(10):809-14 doi 10.1038/nrm1225. 2.Jackson SP, Bartek J. The DNA-damage response in human biology and disease.Nature2009;461(7267):1071-8 doi 10.1038/nature08467. 3.Haince JF, McDonald D, Rodrigue A, Dery U, Masson JY, Hendzel MJ, et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.J Biol Chem2008;283(2):1197-208 doi 10.1074/jbc.M706734200. 4.Altmeyer M, Neelsen KJ, Teloni F, Pozdnyakova I, Pellegrino S, Grofte M, et al. Liquid demixing of intrinsically disordered proteins is seeded by poly(ADP-ribose).Nature communications2015;6:8088 doi 10.1038/ncomms9088. 5.Singatulina AS, Hamon L, Sukhanova MV, Desforges B, Joshi V, Bouhss A, et al. PARP-1 Activation Directs FUS to DNA Damage Sites to Form PARG-Reversible Compartments Enriched in Damaged DNA.Cell Rep2019;27(6):1809-21.e5 doi 10.1016/j.celrep.2019.04.031. 6.Kilic S, Lezaja A, Gatti M, Bianco E, Michelena J, Imhof R, et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments.Embo j2019;38(16):e101379 doi 10.15252/embj.2018101379. 7.Michelini F, Pitchiaya S, Vitelli V, Sharma S, Gioia U, Pessina F, et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks.Nat Cell Biol2017;19(12):1400-11 doi 10.1038/ncb3643. 8.Francia S, Michelini F, Saxena A, Tang D, de Hoon M, Anelli V, et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response.Nature2012;488(7410):231-5 doi 10.1038/nature11179. 9.Soutoglou E, Misteli T. Activation of the cellular DNA damage response in the absence of DNA lesions.Science(New York, NY) 2008;320(5882):1507-10 doi 10.1126/science.1159051.