分析蛋白的方法你选对了吗？ WB、流式 or IHC？

前 言

想必大家对各种分析蛋白的方法都有所耳闻，如我们常用到Western blot（WB）、流式细胞术，及免疫组化（IHC）等。WB常被认为是检验蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白表达，然而并非所有的蛋白分析技术都是WB能解决的，如想了解蛋白在细胞的表达位置，单个细胞水平上蛋白的表达情况如何？这都需要借助其他的技术手段来实现！本期咱们就为大家科普一下，几种常见的蛋白分析技术的应用！

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蛋白表达分析类别

“蛋白表达分析”，其实是一个很笼统的概念。细分下去，主要包含三点：

1. 蛋白表达与否？（定性）

蛋白是否表达是分析蛋白的前提。通过DNA或RNA水平可以检测蛋白对应的基因（如检测基因是否正常敲入或敲除）或mRNA（如检测对应mRNA是否正常/高/低表达）情况，但是蛋白水平的表达与否才是最直接的实验数据。

2. 蛋白表达多少？（半定量，定量）

若目的蛋白表达，接下来就会去关心目的蛋白究竟表达量如何。如何去对蛋白的表达进行定量？也是实验的一个关键点。

3. 蛋白表达在哪里？（定位）

目的蛋白究竟在哪里表达？细胞核，细胞质或者细胞膜上，甚至是分泌到胞外？这个其实就是对于蛋白进行可视化处理，对于蛋白的功能研究具有很大的价值。

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常见的蛋白表达分析技术

了解蛋白表达分析的几个关注点后，下面就结合现在常用的蛋白分析手段对号入座吧！蛋白分析基本原理都是利用抗原抗体结合反应进行识别，目前常用的主要是WB，IHC/IF、流式及ELISA。

1. Western blot（WB，蛋白免疫印迹）简介：WB是大家都会接触到的经典蛋白分析技术。自1979年诞生，至今已经伴随生命科学发展走过了40个年头。它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。蛋白可以来自于细胞，也可是组织样本。

应用：定性和半定量分析！ 通过WB印迹条带有无可以反应蛋白的表达情况，故而可以对蛋白的表达与否进行定性判断；通过Image J等软件进行灰度分析，故而也可以通过灰度值的比较对蛋白的表达量进行半定量分析。

图1. WB原理与效果图

2. 免疫组化（IHC）与免疫荧光（IF）
简介：20世纪40年代，科学家们就通过异硫氰酸荧光素标记的抗体实现了抗原抗体反应的可视化，这是细胞与组织学免疫应用研究的开端。IHC和IF都是利用标记抗体经抗原抗体特异性免疫反应和化学/荧光呈色反应，对组织或细胞内的抗原进行研究的技术。应用：定性、半定量及定位分析！由于IHC与IF的呈色有无可以反应蛋白的表达情况，故而也可以对蛋白在该组织或细胞的表达与否进行直观上的定性判断；由于IHC与IF将免疫反应和高度特异性和灵敏化与组织化学的直观可视性有机地结合起来，在细胞，亚细胞水平甚至分子水平检测蛋白（抗原）的分布及其状态，故而可以实现对于蛋白的定位；通过对呈色区域的灰度值或面积分析，同样可以实现蛋白的半定量分析。注意，这里的半定量仍然无法得到蛋白的具体含量，且分析仅仅限于对应切片或细胞层。

IF的特殊仪器分析：共聚焦激光扫描显微镜（confocallaser scanning microscopy）在免疫荧光的分析中扮演了一个具有强大能力的角色。它的主要特点在于其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成，因此它可以重建结构复杂的物体（如复杂的细胞层或组织片）。对于透明样品，共聚焦可以进行内部结构成像。在做信号通路等研究时，它可以更为直观地检测胞内蛋白的定位（尤其是蛋白入核情况）。

图2. IHC与IF（左图为IHC，淡蓝色为细胞核，褐色是目的蛋白；右图IF为共聚焦成像，蓝色是细胞核，绿色标记的是细胞骨架中的微管蛋白）

3. 流式细胞术（FCM）简介：FCM是以免疫荧光技术为基础而发展起来的一种专门的细胞分析技术，而荧光激活细胞分类器（FACS）是目前分析细胞最具代表性的先进仪器。我们可以通过荧光免疫标记细胞表面抗原或对细胞处理后标记内部抗原，使得细胞带上荧光。在FACS中，通过光的散射信号可以对染色或未染色的活细胞进行分析和分选。

应用：半定量分析！FCM一般不用于定量，主要用于细胞分析和分选。对于特殊的细胞表面标志蛋白（如CD分子），FCM可以将标记后的对应细胞灵敏地分离，并可以得到在此次分析中标记细胞在总细胞数中的比率，从而进行半定量分析。但荧光的强度跟抗体的浓度是有关系的，所以在实验时要保证样品间抗体的浓度相同。

图3. 左：流式细胞术原理；右：FACS分析T淋巴细胞亚群

4. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
简介：ELISA是一种固相酶免疫测定，是目前应用最广泛的一类免疫检测技术。它是将已知抗原或抗体吸附在固相载体上，并仍然保持其免疫活性；将酶标记于抗体或抗原，标记为仍然保持酶和抗体或抗原的原有特性；抗原抗体及酶结合物在固相载体上进行反应，在底物参与下检测显色反应的程度，从而对抗原或抗体进行分析的技术。

应用：定量与半定量分析！现在商用的ELISA试剂盒常用于一个指标多个样本（在96孔板中）的检测，可以通过在酶标仪中OD值的读取进行半定量分析。而且往往商用试剂盒中都会配有标准品，采用已知浓度的标准品做标准曲线就可以做到绝对定量，即准确得到待检测蛋白的具体含量（浓度），灵敏的ELISA可以达到pg级别的蛋白检测，这也是ELISA技术的一大亮点。

图4. 常用ELISA技术的原理示意图

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常用蛋白表达分析技术的比较

其实上述罗列的常用蛋白表达分析技术虽各有千秋，又相互联系。不论是哪一项技术，都离不开免疫标记技术或免疫分析技术，这也反应了免疫学技术在蛋白分析领域的强大应用潜力。但是，不过在具体实践中，我们应该选择哪一种分析手段才是最合适的呢？

WBVS流式细胞术VSIHCVSELISA1. 针对细胞/组织蛋白表达检测（定性和定量）

• WB仍然是经典技术也是金标准，它可用于检测多种类型的蛋白（核蛋白，细胞质蛋白，分泌蛋白），且WB测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般所需一抗1：1000左右，成本较低，因此一般检测蛋白表达和半定量首选WB；除涉及检测细胞膜表面蛋白，多用流式细胞术，不过流式对抗体的需要量很大，比例可高达1:50（比较浪费抗体）；
• WB与IHC技术相比，定量可能更加准确，但若想更直观看到蛋白表达位置和表达量首选IHC；

• ELISA定量准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一（如检测血清、血浆、细胞培养基等样品中的蛋白）。尤其对于微定量分析多个样本非常有用，所用试剂和样品量很少，结果精确。

2. 观察蛋白在细胞的表达位置（定位）

对于IHC来说，定位是它最大的优势。虽然WB也可定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性和直观性远远低于IHC。IHC是组织学水平的检测，因此可以从整体上对蛋白进行定位和半定量，且可以直观揭示细胞内部的信息。而流式是采用细胞群进行分析，最终反映的是细胞群体的特征分布。

3. 针对低表达的蛋白

虽然流式的应用原理和免疫组化、WB没有本质差别，但是由于免疫组化有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用免疫组化或WB更好。但是流式最大的一个特点就是，可以通过电脑定量百分比，故而如果是高表达的用FACS检测非常有优势。

怎么样，看完了小编上述的总结归纳，下一次在分析蛋白表达的时候，是不是有了更清晰的思路和选择呢？当然，说来说去还是那句话，具体问题具体分析，只要在正确的情景中用对最适合的技术，一定会有最好的结果~！