北京大学李毅课题组发现茉莉酸信号通路通过调控RNA沉默关键元件增强水稻抗病毒免疫

虫传病毒导致的植物病毒病害严重威胁着水稻等粮食作物的绿色健康生产。水稻条纹病毒 （Rice stripe virus, RSV） 是水稻条纹叶枯病的病原体。研究发现，RSV除了可以侵染水稻外，还可以侵染小麦、大麦以及玉米等禾本科作物。水稻条纹叶枯病的病症是心叶基部出现褪绿的黄白色斑条，进而发展成沿叶脉分布的黄白色条纹，严重时心叶整片黄化甚至枯死，一般无法抽穗或抽枯穗，导致水稻产量严重下降。

在宿主植物与病毒的长期共同进化中，植物为了抵抗病毒的侵染而进化出了多种防御策略。小RNA介导的基因沉默信号通路是植物抵御病毒侵染最保守的重要策略之一 【1,2】 。病毒侵染后，病毒RNA被宿主的监控系统识别从而激活植物RNA沉默机器，病毒的双链RNA或具有部分双链结构的RNA被植物的DCL酶识别并切割产生病毒来源的siRNA (virus derived small interfering RNA, vsiRNA) 。这些vsiRNA被宿主的AGO蛋白招募形成RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC) ，对与vsiRNA同源的病毒RNA或DNA进行抑制。除此之外，这些vsiRNA还能够进入植物RDR介导的循环信号放大系统将抗病毒RNA沉默信号进行放大 （下图） 。目前的研究主要还是集中在拟南芥等双子叶模式植物中，而宿主响应病毒性病原体侵染的分子机制在包括水稻在内的重要农作物中的研究相对较少。

RNA沉默信号通路介导的植物抗病毒免疫

北京大学李毅课题组致力于水稻宿主与病毒的互作机制研究，包括水稻中RNA沉默介导的抗病毒免疫作用机器。2011年，李毅课题组研究发现病毒侵染水稻能够特异诱导RNA沉默路径中DCLs、AGOs和RDRs等相关基因的高表达 【3】 ，揭示水稻RNA沉默路径在水稻抗病毒中可能发挥重要作用；2015年，该课题组发现并揭示了单子叶植物中特有的AGO18基因的广谱抗病毒作用机制，即水稻AGO18蛋白通过与AGO1竞争性结合miR168，从而释放miR168的靶基因AGO1，AGO1蛋白进一步通过结合vsiRNA介导抗病毒免疫 【4】 ；2017年，该课题组进一步发现AGO18蛋白能够通过结合单子叶植物特有的miR528，释放miR528的靶基因，抗坏血酸氧化酶 （AO） ，AO通过氧化抗坏血酸调节植物体内的氧化还原稳态，促进活性氧ROS的积累，从而增强水稻的抗病毒免疫防御 【5】 ；2019年，该课题组报道了水稻miR528基因在转录水平响应病毒侵染的的具体分子机制，即病毒侵染后，miR528的转录因子OsSPL9的蛋白水平显著下调，导致miR528的转录水平下调。因此，靶基因AO的表达上调，揭示了SPL9-miR528-AO通路在水稻与病毒相互作用过程中的抗病机制 【6】 ，为控制水稻病毒病害提供了新思路。研究报道后，得到国内外同行的正面评价，该课题组被邀请在Current Opinion in Virology和Nature Plants上撰写综述和评论文章 【7,8】 。

虽然RNA沉默通路在植物抗病毒免疫中的作用机制在以模式植物拟南芥为主的体系中研究的较为成熟，但是，对于病毒侵染后，植物如何起始RNA沉默通路的响应，如何激活相关核心原件的表达的相关报道几乎没有。此外，茉莉素 （Jasmonates, JA） 介导的信号通路在植物抵抗真菌和细菌的免疫应答中起到非常关键的作用。近期的研究表明，JA信号通路在水稻抵抗水稻锯齿叶病毒与水稻黑条矮缩病毒侵染的过程中也具有重要的功能 【9,10】 ，但是JA信号通路介导抗病毒免疫反应的具体分子机制尚不清楚，以及JA信号通路与RNA沉默通路介导的免疫反应的关系也有待进一步的研究。

近日，李毅课题组在Cell Host & Microbe发表了题为Jasmonate signaling enhances RNA silencing and promotes rice antiviral defense的研究论文。结合分子、生化和遗传学方法，揭示了JA信号通路对RNA沉默信号通路核心原件AGO18基因的转录调控机制，阐明了JA信号通路与RNA沉默信号通路协同调控水稻抗病毒免疫。在水稻条纹病毒侵染后，病毒能够诱导植物体内JA含量升高，激活JA信号通路，一方面引起JA信号通路中的关键转录因子JAMYB的表达上调；另一方面，伴随着JA含量升高，COI1介导JAZ6蛋白的降解，从而释放JAMYB蛋白的转录活性，进而激活水稻AGO18基因的表达，以启动下游的抗病毒免疫应答。

为了研究水稻对RSV侵染的上游响应机制，研究人员通过对无毒灰飞虱咬食的健康野生型水稻日本晴 （Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare, NPB） 和带毒灰飞虱咬食的具有发病病症的NPB水稻进行JA含量测定，转录组测序，qRT-PCR以及western blots分析。结果发现，病毒侵染后JA含量显著升高，同时，测序结果，qRT-PCR以及western blots的结果表明，许多JA信号通路相关基因在病毒侵染后表达上调，暗示JA信号通路在RSV侵染中可能具有功能。对coi1a （CRISPR/Cas9） 和coi1-13 （RNAi） 突变体进行侵染，发现与野生型NPB相比，其对病毒侵染更加敏感，表明JA信号通路的缺陷导致植物抗病毒防御反应减弱 （下图） 。

coi1相关突变体表现出对RSV侵染更加敏感的表型。

病毒侵染激活JA信号通路，同时RNA沉默信号通路中的一些关键因子也能被RSV侵染诱导 【3】 。因此，研究人员进一步分析了这两者之间是否有关联。通过分析coi1-13 （RNAi） 突变体中，RNA沉默信号通路相关因子的表达情况，发现JA信号通路的缺陷对于RNA沉默信号通路组件的转录水平存在影响，其中AGO1，AGO2和AGO18在coi1-13 （RNAi） 中表达有所下调，而DCL1a，DCL1b，RDR1在coi1-13中表达有所上调。其中，对于AGO18基因的影响最为明显。研究人员进一步通过外施JA处理AGO18p:GUS的转基因水稻发现JA处理能够激活AGO18的启动子，表明JA信号通路能够激活AGO18的转录 （下图） 。

JA信号通路缺陷对RNA沉默组件表达的影响

通过分析AGO18启动子上的顺式作用元件，结合转录组测序与双荧光素酶报告系统筛选，研究人员发现JA响应的转录因子JAMYB参与调控AGO18的转录。先前的研究表明，JAMYB是JA响应的关键转录因子，在水稻中本底表达水平很低，但是能够响应伤害或病原菌的侵染，参与调控细胞死亡介导的植物免疫应答，长期被用作为JA信号通路的标志基因 【11,12】 。但是，对于JAMYB下游调控基因的研究几乎没有。JAMYB基因的表达模式与AGO18的表达模式十分相似。研究人员进一步通过构建DNA结合活性丧失的突变体JAMYBmut，确定了其激活AGO18的转录依赖于其DNA结合活性。在jamyb突变体中AGO18的转录水平显著下调，而在JAMYB过表达的水稻中AGO18的转录水平上调。研究人员进一步通过DNA结合实验和微量热涌动实验确定了JAMYB结合在AGO18启动子上的顺式作用元件。并利用CRISPR/Cas9技术将其结合区域R3在日本晴水稻体内进行缺失突变，确定了该位点对于AGO18转录调控的重要性。结合病毒侵染的实验和遗传学分析发现，JAMYB增强水稻的抗病毒免疫依赖于AGO18。

众所周知，JA信号通路的核心转录因子MYC2，其转录激活活性受到JAZ蛋白的负调控。JAMYB作为响应JA信号的转录因子，此前还没有报道研究其转录激活活性是否也受到JAZ蛋白或其他蛋白的调控。研究人员通过酵母双杂交、双荧光素酶互补实验以及免疫共沉淀等实验方法鉴定到了水稻的JAZ6蛋白能够通过与JAMYB互作，负调控其转录激活活性。同时，JAZ6过表达的转基因水稻对病毒侵染更加敏感，jaz6 （CRISPR/Cas9） 突变体水稻对病毒侵染敏感性降低。这些结果表明，JAMYB除了转录水平受到JA诱导之外，其蛋白活性也受到JA信号通路的调控。

早在1986年，科研人员就发现病毒的外壳蛋白能够介导植物对该病毒产生抗性，并称之为外壳蛋白介导的抗性 （Coat protein mediated resistance, CP-MR） 【13】 。与许多其他病毒一样，RSV的外壳蛋白也能够介导水稻对RSV抗性 【14】 。该课题组早期发现RSV CP过表达的水稻能够激活AGO18的表达 【4】 。在该研究中，研究人员进一步确定在CP过表达水稻中JA信号通路也被激活，表明RSV CP是病毒侵染诱导JA信号通路的因子。那么RSV CP介导的抗性是否与AGO18的表达有关系？为了研究这个问题，研究人员构建了ago18突变体背景下过表达了RSV CP基因的转基因水稻，并通过接种病毒，发现AGO18在CP介导的抗性中起到关键的作用。该发现对RSV CP介导的抗性提出了新的作用机制，即CP作为植物免疫的激活子，通过提前激活植物的免疫反应来增强植物对病毒的抗性。

综上所述，该研究揭示了病毒侵染后植物茉莉酸信号通路与RNA沉默信号通路协同参与水稻抗病毒防御的分子机制，发现了JAMYB作为JA信号响应的转录因子参与水稻AGO18的转录调控。同时，揭示了水稻中独特的RSV CP介导的抗性的作用机制。

北京大学博士后杨志蕊博士和博士研究生黄钰为该论文的并列第一作者，李毅教授为该论文的通讯作者。北京大学许智宏院士、清华大学戚益军教授以及四川农业大学王文明教授为该论文共同作者。该研究得到了国家自然科学基金、国家水稻产业体系项目和博士后创新人才支持计划的大力支持。

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论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.05.001