Nature综述：基因编辑“童话”暗面犹存，效率低下成致命缺陷

近期，Nature 上发表了一篇题为 “The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing” 的论文，阐释了现阶段研究人员在基因编辑领域面临的困境。

近年来，得益于生物学的快速发展，基因组编辑技术频频走进人们的视线中。作为一种新兴治疗技术，基因组编辑技术可以治疗多种单基因疾病或复杂性疾病，科学工作者们也对它寄予了厚望。尤其是近来序列特异性核酸酶技术的发展，将极大助力于致病基因的清除和内源性突变基因的修复。

值得一提的是，超过 7000 种孟德尔遗传病，比如镰状细胞贫血症和亨丁顿舞蹈症，原则上可以通过修复突变基因来治疗。而且一些复杂性疾病或特发性疾病也可以通过靶向特定基因治疗，比如年龄相关性黄斑变性疾病中的促血管生成因子或者肿瘤相关的抗原。

早期的基因工程技术只能将外源或内源遗传物质随机插入宿主基因组，基因编辑则能定点编辑想要编辑的基因。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂（DSB），诱导生物体通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来修复 DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。这种靶向突变就是基因编辑。

被誉为 “基因魔剪” 的 CRISPR/Cas9，早已为大众耳熟。研究人员们可以用它来清除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，为治疗人类疾病提供了广阔的前景。可是，“童话”真的如听起来这般美好吗？

图丨基因编辑治疗疾病路径（来源：Nature）

实际上，无论是什么疾病、DNA 序列如何变化，亦或是在体内还是体外进行基因编辑，实验的成功与否都受到递送效率的制约。

基因编辑技术已经进入了人体临床试验阶段。然而，在完全实现治疗性基因编辑的愿景之前，研究人员面临的挑战也长期存在。过去的几十年间，在研究如何递送蛋白质和核酸时，科学人员们发明了多种基因传递技术，在基因编辑的过程中发挥了至关重要的作用，包括用于基因治疗的腺相关病毒载体和慢病毒载体，还包括用于递送蛋白质和核酸的脂质纳米粒以及非病毒载体。然而，这些载体的传递效率较为低下，靶向特异组织的能力不足，同时基因编辑的工具酶也需要得到优化。还有一系列组织特异性和免疫原性等的问题，可谓挑战重重。其实，大分子的传递问题一直以来都是限制核酸疗法发展的关键瓶颈，对于研究人员来说已经是老生常谈了。举个例子，通过用正常基因取代致病基因来治疗单基因隐性疾病的基因疗法，最近在治疗 B2 型血友病、腺苷脱氨酶缺乏症和 2 型利伯氏先天性黑内障方面取得了临床成功。可是，腺相关病毒载体，逆转录病毒和慢病毒载体的发展，成为了实验进程中最大的阻碍。

基因组编辑治疗需要在体内或者体外将内切酶导入细胞，而用于基因编辑的酶通常体积较大，并且需要同时将多个大分子导入一个细胞，这给研究人员带来了不小的挑战。

一方面，在以病毒为载体的传递方式中，一些酶的体积可能会超过载量。尽管腺相关病毒和慢病毒的 DNA 载量足够支持大部分的基因替代疗法（人类蛋白质的平均大小是 375 个氨基酸，即 ±1.2 kb cDNA），还是无法满足基因编辑的工具酶要求的 ±4.1 kb cDNA，即化脓性链球菌中的 Cas9(SpCas9)加上一个向导 RNA 编码基因的大小。通常来说，dCas9 与辅助蛋白融合后还会超过 ±4.1 kb cDNA。

另一方面，涉及到重组介导的 DNA 修复时，供体模板的载量会明显增加。因此，研究人员不仅需要找到或者设计更小的 Cas9 变体，而且还需要研究出容载量更大的载体。此外，锌指核酸酶和归巢核酸内切酶的大小分别只有 2kb 和 0.7kb，也可以用于递送。

基因组编辑机器的递送靠许多的病毒载体来完成，包含腺相关病毒（AAV）、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、仙台病毒和杆状病毒载体。然而，大多数研究中都使用了 AAV 和慢病毒（见下图），它们具有互补优势。

图 丨递送分类及详情（来源：Nature）

尽管前方道路千难万险，基因编辑的 “童话梦” 也并未就此破碎。现阶段，研究人员已经发现了许多颇有成效的方法和目标组织，给治疗性基因编辑的发展带来希望。

体外传递

在人类第一个基因组编辑临床实验中，实验人员先提取 T 细胞，在体外利用带有锌指核酸酶的腺病毒载体转染 T 细胞，使其表达一个抗 CCR5 的锌指核酸酶。因为艾滋病是通过 CCR5 进入 T 细胞，这样一来 T 细胞就可以抵御艾滋病的感染。将被敲除 CCR5 的 T 细胞注射进人体内以后，相较于普通 T 细胞，这些改造后的 T 细胞在停抗 HIV 药后存活更久，并且大部分受试者的体内艾滋病 mRNA 的循环水平降低了。

AAV 还被用于体外递送，一个有趣的现象是，当 AAV 介导的基因组编辑在没有核酸酶的情况下，会用一个 DNA 供体来替代。特别是，Russell 及其同事发现，将构建的供体嵌入到 AAV 基因组中，产生的 HDR 率比对应的供体质粒的 HDR 率高几个数量级。利用这种特性将部分白细胞介素 - 2 受体亚单位 -α(IL2RA)cDNA 插入到小鼠和人类造血干细胞的相应位点中，随后能够使小鼠受体重新增殖 -- 这项工作对治疗 X - 链接的严重联合免疫缺陷具有意义。

体内传递

研究人员在病毒载体方面倾注了很大的心血，特别是用于体内基因编辑的 AAV 和主要的目标组织肝脏。通过 HDR 介导将 cDNA 整合到一个高表达的内源性位点中，可以实现强有力的转基因表达，研究人员已经用这种策略来治疗血友病，通过将 ZFN 介导的相应 cDNA 敲入强表达的白蛋白位点后，肝脏分泌了高水平的因子 VIII 和因子 IX。另一个例子是，在第一个涉及体内基因组编辑的人类临床试验中，将编码该酶的 cDNA 敲入白蛋白位点后，肝脏中的艾杜糖醛酸 2 - 硫酸酯酶活性达到了潜在的治疗水平。

中枢神经系统也是一个很有潜力的基因编辑治疗的目标组织，尤其是敲除致病等位基因以后有望治疗许多常染色体显性单基因疾病。举个例子，最近研究人员已经使用双载体 AAV 递送 SpCas9 来阻止突变亨廷顿蛋白的表达，虽然并未增加实验小鼠的寿命，但减轻了神经中毒和运动障碍。研究人员还进一步推进了向导 RNA 的工程化来表达亨廷顿病的等位基因特异性（即敲除突变等位基因的同时保留野生型（WT）等位基因）。

视网膜也是治疗性基因组编辑另一个颇有前途的目标组织，特别是考虑到许多单基因视网膜疾病的生物学特性良好，动物模型的可用性，临床的短期可实现性，以及由 FDA 批准的 LCA24,52,53 的基因治疗产品。致盲疾病 10 型伯氏先天性黑内障中最常见的基因突变会产生一个隐蔽剪接位点，从而破坏 CEP290 蛋白质的表达。一个已经进行到 1 期临床试验的研究是利用双载体 AAV5 系统来递送 SpCas9 和两个 gRNA 来切除人类基因组中的突变。

肌肉萎缩症是另一个备受期待的体内基因编辑目标组织。一些设计巧妙的研究使用双载体系统一个编码 SpCas9 和两个 gRNA 的 AAV8 和 AAV9 系统切除过早出现终止密码子的肌营养不良症（DMD）外显子，以治疗假肥大肌营养不良症（DMD）。之后，外显子跳过恢复肌萎缩蛋白的表达，功能接近 WT，显著增强骨骼肌的功能。还有研究则使用双 AAV6 载体系统递送 Cas9 和一个 HDR 供体去交换无义突变的密码子，以实现期许的体内编辑效率。此外，另有研究在小鼠模型中使用 AAV9 双载体系统递送 SaCas9 和两个 gRNA 治疗先天性肌营养不良症，他们切除了一个致病性剪接位点突变，然后恢复了层粘连蛋白α2 基因中的一个外显子，最终改善骨骼肌组织和功能。

基因编辑的未来，应该何去何从？

近年来，基因组编辑疗法取得了喜人进展，从基础研究到临床前开发，再到进入人体试验，特别是在体外造血干细胞和 T 细胞的编辑以及体内肝脏的基因组编辑方面，这些都得益于相关的高效递送方法。

然而，在充分实现基因组编辑的远大前景之前，还有一些相当艰巨的挑战需要克服。

首先是最为诟病的递送效率低的问题，目前在许多组织中，HDR 修复甚至敲除效率都很低，所以需要更高效率的递送去补偿。其次，还需要能够容纳碱基编辑、质粒编辑甚至一些核酸酶的高效单载体，或者更加高效的双载体。最后，需要能够瞬时表达或拥有快速开关的载体，以避免体内延时表达可能引起的基因毒性和免疫原性。我们需要构建高通量载体，像是利用病毒的定向进化或者非病毒载体的组合化学，都是很好的应对挑战的工程方法。除了病毒的定向进化，固体脂质纳米粒的结合也可以快速提升小分子干扰核糖核酸（siRNA）递送至肝脏的效率，这些方式也可以加强用于基因修改的酶的传递效率。递送效率低下，将一直作为治疗性基因编辑发展的症结所在。只有攻克了这一难题，基因编辑的美好童话才能得以实现。