欧阳能太教授：BRCA基因检测性能验证要点总结

聆听大咖讲解NGS检测BRCA基因性能验证要点。

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA)检测有着重要的临床意义，不仅可以评估某些肿瘤发病风险而且影响着临床精准诊疗方案的制定。随着BRCA基因二代测序（NGS）检测的普遍开展，BRCA1/2基因检测的性能验证也越来越重要。在此，我们有幸邀请到来自中山大学孙逸仙纪念医院细胞分子诊断中心的欧阳能太教授为我们讲解BRCA1/2基因检测性能验证的主要内容及影响因素。

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BRCA基因检测性能验证的

主要内容及影响因素概述

NGS检测BRCA基因的全流程主要有湿实验和干实验两大部分，其中湿实验包括样本评估、DNA提取、文库构建、文库质控、混样计算和上机测序，干试验包括碱基识别、序列比对、变异识别、变异注释、数据质控及报告生成。整个流程中每个环节都至关重要，也是影响BRCA1/2基因性能检测的主要因素。BRCA基因检测所用的检测试剂是在厂家实验室进行性能验证，出厂后任何实验步骤或环境的改变，均可能改变检测性能、影响结果，因此需要我们重新做验证。

BRCA基因检测性能验证涉及的主要方面有试剂质量、SOP（标准操作流程）、人员操作技术、环境因素、测序仪性能、分析流程等。性能验证的具体项目包括符合率（针对不同试剂的检测结果）、准确率（针对不同方法的检测结果）、 重复性（针对不同操作员的检测结果）、灵敏度、数据监控确认和分析流程（Pipeline）。其中，分析流程的验证这一项尤为重要，需要我们准确理解和掌握。NGS检测数据下机后要进行以下四个流程进行分析，分别为碱基识别、序列比对、变异识别、变异注释。一般来说，分析流程和检测试剂是配套的，每一个步骤都会对应一个质控点文件（图1），分析流程中每个环节出错都会影响BRCA基因检测的结果。

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BRCA基因检测性能验证重要内容的具体解析

接着，欧阳能太教授从自身的临床实际出发，以具体的性能验证实例为我们阐述了BRCA基因检测性能验证的重要内容。

首先是符合率的验证，欧阳能太教授讲道，我们利用待验试剂和对照试剂（标准试剂）检测了279例样本，结果显示阳性符合率100%，阴性符合率94.6%。对于阴性符合率只有94.6%，即出现与对照试剂检出结果不一致的情况下，需要我们进行准确率的验证，最后经Sanger法验证与待验试剂检测结果是一致的，因此待验试剂和对照试剂检测结果实际的符合率为100%。

其次是重复性的验证，需要两个技术员分别对同一批标本进行操作，对检测结果统一上机，统一分析，比较两个不同操作人员得出的结果即变异信息和变异频率是否一致。这种重复性的检测需要进行三次。对于灵敏度的验证，需要利用现有的平台及试剂对已知阳性标本进行BRCA基因检测分析，观察其突变频率及变异分类与已知阳性样本信息是否符合。

除了以上几点需要做性能验证外，我们也要重视BRCA基因检测试剂说明书中包含的检测覆盖范围。例如所用的试剂盒声称可以针对BRCA1基因和BRCA2基因全编码区及外显子-内含子连接区、UTR区（非翻译区）和启动子区的突变进行检测，那么我们需要对其声称的检测覆盖范围进行验证，利用NGS数据分析过程中序列比对形成的bam 文件可以对试剂声称的检测覆盖范围进行核对验证。另外，如果试剂说明书声称可以检测大片段缺失，则需要用MLPA方法验证大片段缺失检测的性能，若说明书中未包括大片段缺失的检测则需要在我们常规的BRCA NGS检测后加上大片段缺失的检测。

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日常BRCA NGS检测性能的全流程质控

以上所述BRCA基因检测性能验证的内容是在开展BRCA检测项目时必须要进行的，而在日常的NGS检测BRCA过程中还需要进行“延伸的”性能验证，即NGS检测性能全流程质控，如文库质控、簇密度、簇通过率、数据量、Q30、测序深度、覆盖度、变异分类等重要内容。不断的发现问题，分析解决问题，不断细化 SOP，从而保障BRCA检测的准确性和结果的可靠性。

在本次报告中，欧阳能太教授列举了临床实践中经历的具体实例来让大家更好的理解日常NGS检测 BRCA过程中性能验证的重要性。在一项BRCA基因检测中NGS下机后的数据显示簇密度 112K/mm 2 ，簇通过率 98.6%，数据量80.3M ，Q30 98.8%。我们发现簇密度明显低于正常，数据量也明显下降。该结果是由什么原因造成的呢？

从常规分析来看可能的原因有文库构建失败，上机浓度过低，仪器故障，操作误差等。为分析解决问题，我们复查了检测流程表，显示DNA浓度、文库片段大小和文库浓度均合格；利用剩余文库在另一实验室上机发现测序结果及分析结果正常，这说明文库构建没有问题，问题可能出现在上机测序这一环节；重新混合文库，测浓度未发现异常，也确认了试剂批号没有改变；仪器工程师分析数据，未发现仪器异常因素。我们不断寻找可能造成该结果的细节问题，后来发现检测上机使用的NaOH pH值偏低，我们使用新配制的NaOH后，一切正常。这表明NaOH反复开盖使用可能导致不稳定，文库变性失败导致了不合格的结果。

从这一案例中得出的经验就是我们在日常的NGS检测中需要重注操作细节，出现问题时及时分析问题解决问题，不断进行性能验证，从而得到准确可靠的BRCA检测结果。

最后，欧阳能太教授对本次报告做了总结和梳理：

• BRCA NGS检测全流程所有环节均可能会影响检测性能；

• 实验室对所有项目均应经常进行性能验证或监控；

• 常规性能验证包括符合率、准确率、重复性、灵敏度等，BRCA检测数据可通过IGV查看，确认覆盖范围；

• 临床生信员应掌握NGS数据分析方法，对簇密度、数据量、测序深度、覆盖度、Q30等指标要进行日常性地监控，及时发现问题，解决问题；

• 如检测试剂声称能检测大片段缺失，需要用MLPA法进行进一步的验证。

审批编号CN-47110；过期日期2021-4-28