撰文 | Leon
责编 | 雪月
RAF激酶家族通过RAS-RAF-MEK-ERK信号通路调控细胞的增殖、生长、分化和存活。RAF的激活突变常见于多种肿瘤细胞【1-3】。靶向BRAF V600E突变的小分子药物包括达拉菲尼（dabrafenib）、维莫菲尼（vemurafenib）和恩可拉非尼（encorafenib），它们在临床应用中展现了不错的效果，但是耐药性的产生限制了它们的长期使用。这些小分子抑制剂主要通过结合于RAF的催化口袋发挥功能，却不能抑制RAF活化的另一个关键环节——二聚化，因此不能完全抑制RAF的活性【4-9】。
蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras，PROTACs）利用双功能小分子诱导蛋白质降解，该技术的基本原理在于利用细胞自身的泛素-蛋白酶体系统来达到降解靶标蛋白的目的（详情请见BioArt报道：陈益华团队开发出新型PROTAC蛋白降解剂 | 突破，首个降解KRAS^G12C的高活性PROTAC）。
2020年8月10日，加拿大的Marc Therrien和Frank Sicheri课题组在Nature Chemical Biology杂志发表了题为Functional characterization of a PROTACdirected against BRAF mutant V600E的论文，使用PROTAC降解V600E突变的BRAF，并在细胞和分子水平验证了这种策略PROTAC相对于小分子抑制剂的优越性。
首先，实验人员设计并且合成了一系列可以同时靶向BRAF和不同E3泛素连接酶的PROTAC分子，从中选出了最高效的分子，命名为P4B（图1）。该分子由两部分组成：处于临床前阶段的BRAF抑制剂BI 882370，以及能够结合E3连接酶cereblon的pomalidomide/thalidomide。实验者在人黑色素瘤细胞系A375和HEK293T细胞进行验证，发现小分子的确能够诱导BRAF-P4B-E3三元复合体的形成。该PROTAC可以促进目标蛋白的降解、抑制癌细胞的增殖。
图1. 靶向BRAF的小分子PROTAC（P4BMe作为对照分子，不结合E3连接酶）
进一步，作者还比较了不同肿瘤细胞系（黑色素瘤、肺癌）对P4B分子的敏感度差异。NCI-H1666细胞系携带BRAF的G466V突变，这使它对传统的BRAF抑制剂不敏感。然而，P4B能够很好地对其发挥抑制效果。A375-VR细胞系不仅携带BRAF的V600E突变，还带有BRAF激酶结构域的串联重复突变，致使其对传统的BRAF抑制剂产生耐药。但是，由BRAF抑制剂改造而来的P4B还是能够抑制这些癌细胞的增殖。
然后，研究人员解析了P4B分子与BRAF激酶结构域结合的晶体结构，分辨率为3.29 （图2）。从晶体结构中可以看出，P4B的BI 882370部分结合于BRAF的ATP结合口袋，其构象与单独的BI 882370分子的结合模式类似，说明把BI 882370改造为PROTAC后，linker区域和招募E3连接酶的pomalidomide并不影响BI 882370对BRAF的结合。
图2. P4B与BRAF激酶结构域的复合体晶体结构
这项研究证明，靶向BRAF的PROTAC或许可以为临床上BRAF抑制剂的耐药问题提供新的解决方案。最后，作者指出，由于在细胞中BRAF存在多种状态（自抑制状态的单体或有活性的二聚体），如果PROTAC可以特异性靶向其中一种BRAF构象，那么它们的临床应用价值将会更高。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41589-020-0609-7
参考文献
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