Nature | 什么？Ki-67除了细胞增殖标记物又现新功能？

撰文 | 十一月

责编 | 兮

真核细胞中的基因表达需要核内转录和RNA加工与胞质内的翻译过程有效的分离【1】。这种分离过程是由控制大分子出入的核膜所建立的【2】。但是在有丝分裂过程中，动物和植物细胞核膜崩解，使得细胞质和细胞核中的组分混合【3】。当核膜再次形成的时候，细胞质中的组分会通过受体介导的核孔运输从细胞核中运送出去达到核质组分分离的目的【2】，但是核孔的大小只能让直径小于39nm的粒子通过。那么就带来一个问题：细胞有丝分裂时期退出后，尺寸较大的细胞质组分是如何从细胞核中清除出去的呢？

2020年9月2日，奥地利维也纳生物中心Daniel W. Gerlich研究组与Sara Cuylen-Haering（第一作者）合作发文题为Chromosome clustering by Ki-67 excludes cytoplasm during nuclear assembly，揭开了一直以来作为组织中增殖潜力细胞标记物的Ki-67在有丝分裂期退出后核质物质分离过程中的重要作用。

为了对细胞分裂后尺寸较大的细胞质组分从细胞核中分离出去的机制进行研究，作者们使用了基因编码的多聚体纳米颗粒（Genetically encoded multimeric nanoparticles，GEMs）【4】，该纳米颗粒的直径是41nm，刚好是核孔不能够通过的分子直径。作者们将GEM组分encapsulin挂上eGFP与染色质标记物H2B-mCherry在HeLa细胞中进行成像后发现在细胞间期GEM颗粒只存在于细胞质中而非细胞核中，因此该系统非常适合于研究活细胞有丝分裂过程中核质物质分离过程。

进一步地，为了揭开41nm的GEM颗粒在核膜崩解和重建过程中的具体分布模式，作者们继续对细胞进行了活体成像。作者们发现在细胞分裂前期核膜未崩解时GEM在细胞核中的分布的强度很低，但是核膜崩解细胞进入有丝分裂前中期后GEM的分布快速地与染色体区域混合（图1）。在有丝分裂后期，GEM颗粒最初大量地定位在染色体之间，然后随着姐妹染色单体分离到纺锤体极点而被逐渐排除。因此，41nm的GEM颗粒有丝分裂过程中的分布特点是有丝分裂期与染色体混合，但是在有丝分裂期退出后分离。

图1 41nm GEM颗粒成像观测在核膜崩解以及随后的重建过程中的分布特点

进一步地，作者们对成熟核糖体组分是否与GEM颗粒的分离过程相似进行了验证。作者们使用核糖体蛋白组分L10进行成像后发现在有丝分裂后期一开始，大多数成熟的核糖体颗粒会从染色体区域被排除。为了揭开GEM颗粒和成熟核糖体在分裂后期被排除出去与核膜形成的时间点的关系，作者们对核运输蛋白进行成像后发现该底物在后期开始六分钟左右的时间点积累在染色体区域，但是GEM颗粒和成熟核糖体组分在分裂后期的一开始五分钟之内就已经几乎完全排除在染色体区域之外了。这些结果说明GEM颗粒和成熟核糖体是在核膜中核孔运输组分形成正常功能核孔之前就已经被排除在细胞核之外了。另外作者们通过核孔抑制剂发现核质组分的分离不依赖于核孔介导的运输功能。

GEM颗粒和核糖体被排除与染色体移动逐渐形成致密的聚集区域是偶联进行的，因此作者们想知道是否是染色体的排布控制了核质的区室化分隔。分裂后期的染色体通过纺锤体介导的向极拉扯而靠近，但是在分裂后期染色体非常密集的出现表明可能涉及不依赖于纺锤体的机制，因此作者们首先想要检测纺锤体是否参与其中。作者们建立了一个纺锤体独立的染色体聚集细胞系统，在使用诺考达唑（Nocodazole）解聚微管造成没有纺锤体的情况下对细胞使用有丝分裂激酶CDK1抑制剂flavopiridol促进有丝分裂退出过程的发生。作者们发现在缺少纺锤体的情况下，仍然能够在有丝分裂退出时期形成染色体聚集（图2）。

图2 无纺锤体染色体聚集系统

那么是什么因子调节染色体聚集的呢？作者们想到的其中一个备选蛋白是BAF（Barrier-to-autointegration factor）因子，BAF因子能够通过在后期染色体上交叉桥连（Cross-bridging）DNA的方式稳定后期的染色体。但是作者们发现通过RNAi敲低BAF后对于染色体聚集或者GEM排除等过程都没有明显的影响，因此染色体聚集过程可能是由其他的因子而非BAF所调控。前人的研究表明在减数分裂前中期，染色体会被蛋白Ki-67排斥性表面所分开【5】，而在有丝分裂期退出后会被移除或者是失活。Ki-67在有丝分裂前期在染色体表面形成分子刷，C端与染色体表面结合，N端延伸到细胞质中【5】。为了测试Ki-67在有丝分裂退出过程中是否通过重组其刷状分子排列而失活，作者们在Ki-67两端分别用不同的荧光蛋白进行标记以确定蛋白两端的位置。作者们惊讶地发现在有丝分裂前中期Ki-67蛋白两端的距离是66 ± 27 nm，但在flavopiridol施用染色体聚集后Ki-67蛋白两端的距离缩短到32 ± 32 nm（图3）。通过基因敲除和回补的遗传操作实验作者们确认Ki-67蛋白活跃地参与有丝分裂退出过程中染色体聚集。

图3 有丝分裂退出过程中延伸的Ki-67蛋白两端发生坍缩

总的来说，作者们发现有丝分裂退出过程中的染色体相互作用有助于动物细胞的核质区室化分隔。在分裂后期染色体首先通过期纺锤体靠近然后通过Ki-67调控的表面紧密聚集，这样在核膜封住细胞核之前，尺寸较大的细胞质组分被排除出去（图4）。染色体聚集防止了不能通过核孔出口排除的较大可溶颗粒对混入细胞核，从而使细胞质和细胞核的有效分离成为可能，同时该研究对Ki-67的功能进行了进一步地补充和扩展。

图4 工作模型

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2672-3

制版人：MENG

参考文献

1. Maniatis, T. & Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines.Nature416, 499-506, doi:10.1038/416499a (2002).

2. Grlich, D. & Kutay, U. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm.Annual review of cell and developmental biology15, 607-660, doi:10.1146/annurev.cellbio.15.1.607 (1999).

3. Ungricht, R. & Kutay, U. Mechanisms and functions of nuclear envelope remodelling.Nature reviews. Molecular cell biology18, 229-245, doi:10.1038/nrm.2016.153 (2017).

4. Delarue, M. et al. mTORC1 Controls Phase Separation and the Biophysical Properties of the Cytoplasm by Tuning Crowding.Cell174, 338-349.e320, doi:10.1016/j.cell.2018.05.042 (2018).

5. Cuylen, S. et al. Ki-67 acts as a biological surfactant to disperse mitotic chromosomes.Nature535, 308-312, doi:10.1038/nature18610 (2016).