Nature | 膜内分子伴侣复合物协助膜蛋白的生物合成

撰文 | 十一月

责编 | 兮

在真核生物中大约25%的蛋白质编码基因编码细胞所必须的膜蛋白 【1】。膜蛋白最主要插入、被修饰以及折叠的细胞器是内质网。但是过去几个世纪关于膜蛋白是如何靶向内质网以及跨膜结构域是如何插入磷脂双分子层的研究还未见定论 【2】。

为了对该问题进行解析，2020年8月19日，英国剑桥MRC分子生物学实验室Ramanujan S. Hegde研究组发文题为An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis，发现了包含保守的内质网膜蛋白CCDC47以及Asterix在内的异源二聚体PAT复合物以及其在协助膜蛋白生物合成中的重要作用。

多次跨膜蛋白具有很多功能比如跨膜运输、细胞内相互作用以及细胞表面受体等等 【3】。这些功能中的一些可能需要蛋白的跨膜结构域不仅仅作为简单的膜锚定区域发挥作用。比如说受体蛋白或者转运蛋白需要跨膜结构域特定的亲水表面来协助蛋白发挥生理功能 【3】。因此，多次跨膜蛋白的跨膜结构域具有多种不同的长度、序列特点以及生物物理性质。当跨膜蛋白被折叠时，多次跨膜蛋白的跨膜结构域通常会被包裹在内使其亲水性区域彼此面对，而向周围磷脂双分子层呈现出一个几乎不受干扰的疏水性表面 【4,5】。但是半亲水性的跨膜结构域是如何在膜内保持稳定直到末端跨膜结构域装配完全的还不得而知 【2】。

图1 GPCRs七次跨膜结构域示意图

为了找到协助跨膜蛋白生物合成的相互作用的分子伴侣，作者们对G蛋白偶联受体GPCRs生物合成过程中不同阶段中间产物的相互作用伴侣进行鉴定。GPCRs是一大类跨膜蛋白，具有七次跨膜结构域 （图1）。作者们对牛视紫红质GPCR蛋白的前两个跨膜结构域 （transmembrane domains，TMD）进行标记并以正确的朝向插入内质网来源的粗面微粒体 （Microsomes）中 （图2）。翻译停滞的复合物中包含不同长度的新生多肽，可以通过在跨膜结构域TMD1区域引入的半胱氨酸 （图2）与邻近的蛋白发生相互作用，可以用该方法“钓到”协助跨膜蛋白生物合成的分子伴侣。在早期阶段 （TMD1产生和插入的阶段），半胱氨酸交联主要钓取到的是与核糖体相关蛋白。其中并未发现EMC （ER membrane protein complex）复合物帮助TM1插入内质网，可能是由于该相互作用比较短暂，所以未被半胱氨酸交联的方法捕获。随后TMD2从核糖体中逐渐出现，作者们发现出现了一个大约10kDa的蛋白质交联信号，作者们认为这可能是先前研究 【6】中提到的“与内质网易位子相关的10kDa的蛋白” （Protein associated with the ER translocon of 10 kDa），所以作者们将该蛋白命名为PAT10 （图3）。另外，作者通过对TMD1-PAT10复合物进行蔗糖梯度离心发现其总分子量大于100kDa，这给了作者一个提示PAT10是可能是一个较大的复合物的中的一部分，该复合物随后被称为PAT复合物。

图2 牛视紫红质前两个跨膜结构域示意图

图3 哺乳动物视紫红质跨膜结构域跨膜示意图

为了鉴定出PAT复合物中的包含的组分，作者在非变性的条件下对交联反应进行溶解将核糖体中新生的肽链释放，通过对Flag标记进行蛋白亲和纯化对共同纯化下来的蛋白进行质谱分析。其中有六个蛋白相对于对照组来说富集程度超过两倍：Sec61α、Sec61β、Calnexin、Galectin7、SPP以及CCDC47。其中Sec61α、Sec61β以及SPP能与新生肽链发生直接相互作用。在剩下的候选蛋白中，CCDC47引起了作者的注意，因为通过CCDC47的抗体可以直接通过生化实验证明CCDC47与PAT10的相互作用而其他的比如SPP蛋白并不能通过抗体检测出相互作用。而且在微粒体中也发现新生的蛋白中富集CCDC47，在微粒体中敲除CCDC47后这种富集会消失。这些结果说明CCDC47与膜蛋白发生相互作用，该作用是特异性的并且是PAT复合物的一个非常稳定的组分。

另外，作者还发现两种抗CCDC47抗体的生化实验发现了CCDC47的相互作用蛋白Asterix。通过Asterix抗体可以特异性的检测到与PAT10的相互作用。值得注意的是，CCDC47与Asterix不仅仅可以发生相互作用，更重要的是两者形成了一种专性复合体，敲低或者敲除两者之一后另外一个也会受到影响。因此，作者们最终确认PAT复合物的组分是CCDC47以及Asterix。

图4 PAT复合物在膜上发挥分子伴侣功能的模式图

那么PAT复合物是如何影响膜蛋白的呢？使用siRNA对PAT复合物进行敲低后作者发现对尾锚定蛋白SQS几乎没有影响但是五种GPCRs的生物合成都出现了明显地降低，说明PAT复合物对于多次跨膜蛋白的优化生物合成是非常重要的。通过对跨膜结构域中的氨基酸进行置换，作者发现亲水性的TMD会与PAT复合物相互结合协助其进入磷脂双分子层。另外，通过对β1AR成熟折叠的蛋白以及蛋白短截片段作为不完全折叠蛋白进行检测会后，作者发现PAT复合物会释放折叠完全的蛋白底物。

总的来说，Hegde研究组的工作发现PAT复合物作为在内质网存在的分子伴侣复合物直接与新生蛋白的跨膜结构域发生相互作用，在底物蛋白正确折叠后会被释放，该过程对于膜蛋白的优化合成是非常关键的。因此，Hegde研究组的工作揭开了跨膜蛋白在最终形成稳定折叠结构过程中促进跨膜结构域的正确装配的分子伴侣。

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2624-y

制版人：琪酱

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1 UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic acids research 45, D158-d169, doi:10.1093/nar/gkw1099 (2017).

2 Shao, S. & Hegde, R. S. Membrane protein insertion at the endoplasmic reticulum. Annual review of cell and developmental biology 27, 25-56, doi:10.1146/annurev-cellbio-092910-154125 (2011).

3 von Heijne, G. The membrane protein universe: what's out there and why bother? Journal of internal medicine 261, 543-557, doi:10.1111/j.1365-2796.2007.01792.x (2007).

4 Lu, P. et al. Accurate computational design of multipass transmembrane proteins. Science (New York, N.Y.) 359, 1042-1046, doi:10.1126/science.aaq1739 (2018).

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6 Meacock, S. L., Lecomte, F. J., Crawshaw, S. G. & High, S. Different transmembrane domains associate with distinct endoplasmic reticulum components during membrane integration of a polytopic protein. Molecular biology of the cell 13, 4114-4129, doi:10.1091/mbc.e02-04-0198 (2002).