常有小伙伴抱怨：走过最长的路，就是 WB 实验的弯路。在上一期，我们的指南教大家如何应对常见的的问题。WB 实验时，还会遇到各种奇葩现象，比如非特异性条带和高背景，怎样才能获得背景干净的条带呢？这期我们继续来解疑。
非特异性条带，杂草丛生为哪般？
WB 显色后膜上有非特异条带或高背景是实验常见的问题，每一个实验细节可能会决定成败，例如抗体稀释液中 NaCl 成分和脱脂牛奶的比例就与非特异条带密切相关，下图的示例中，5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl 的体系下，非特异性条带更少。
利用 R&D Systems 兔抗人 PTP1B 亲和纯化多克隆抗体（货号 AF1366）对 WB 实验进行优化。每个样本裂解 1×105 个细胞，并溶于 SDS 胶缓冲液进行 SDS-PAGE 蛋白分离：人 HeLa 细胞（Lane1）、MCF-7（Lane2）和 TF-1（Lane3）。电泳后，蛋白转膜至 Immobilon-P 膜，并在下述条件下免疫印迹，曝光时间为 30s。A，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl；B，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15M NaCl；C，5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5M NaCl。
除以上原因，其它与实验体系有关的原因及解决方法总结如下：
下面重点了解，与样品中目的蛋白特性有关的、需要考虑的因素：
比如目的蛋白表达水平低，为检测到目的条带，需要提高上样量，结果中易出现杂带。
◆以 PHD3 为例
其也被称为 Egl 9 homolog 3 (EGLN3)，是一种广泛表达的脯氨酰羟化酶，理论分子量约为 27 kDa，它能羟基化靶蛋白如 HIF-1 alpha (Hypoxia-inducible factor) 上的脯氨酸残基。
在氧含量丰富的情况下，HIF-1 的 alpha 链会被 PHD 家族成员羟基化，从而导致其泛素化和降解。在低氧压力下，羟化反应减弱，HIF-1 alpha 亚基保留，HIF-1 得以入核，增加低氧相关基因的表达。
在典型的 HIF 信号通路中，PHD3 更多的影响 HIF-2 alpha。在大多数细胞类型中，HIF-2 alpha 受 PHD3 负调控，但有研究显示，在透明细胞性肾癌细胞 (ccRCC) 中 PHD3 高表达，并可维持 HIF-2 alpha 高表达。
所以，对于 PHD3、HIF-1 alpha 和 HIF-2 alpha 三种蛋白，通常在常氧条件下，在许多组织或细胞中表达量偏低，难以检测到，通常细胞需经过诱导后才可见表达量升高。如上图所示，使用 HIF-1 alpha Antibody (NB100-105) 检测由 CoCl2 诱导前和诱导后，Caki-1 细胞中 HIF-1 alpha 的表达。
使用 Novus Biologicals 的 EGLN1/PHD2 Antibody (NB100-138) 和 EGLN3/PHD3 Antibody (NB100-139) 显示 HIF 羟化酶在原代大鼠肝细胞的细胞核和膜定位。以 COS-7 细胞核提取物作为对照，Normox：常氧条件，Hypox：缺氧条件，Reox：复氧条件 (图片来源：doi: 10.2353/ajpath.2006.060360)。
对此，针对 PHD3 的 WB 检测，有一些减少背景非特异条带的方法：
降低上样量。蛋白上样量过高，可能会导致高背景和非特异条带。
建议不要使用 2% SDS（阴离子）裂解缓冲液处理样品。因为这种裂解液有时会导致抗体的背景升高。使用 NP-40 或 RIPA 最好。在 Novus 官网有裂解液中各种成分的说明，可以点击此处参考。另外，将样品在 95°C 下煮沸 5 分钟冷却后再上样更好。
减少转膜时间（通常 90V/1h，甚至更少），因为较小的蛋白质（例如 PHD3）转膜速度会更快。
将膜在室温下封闭 1 小时，洗膜 3 次，每次 5 分钟。封闭时间过长和过度洗涤会导致高本底并阻碍检测。
用封闭液稀释一抗。前期验证发现 BSA 会引起该抗体产生高背景，所以我们建议使用封闭液 5% 脱脂牛奶稀释一抗。
如果前期二抗工作浓度偏高，我们建议增加稀释比例，并只将二抗孵育 1 小时。设置去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。
值得注意的是，上表的因素中，由蛋白翻译后修饰（如糖基化等）、蛋白多亚型而出现的多条带，并不是非特异条带，需要根据文献及对照实验来多方面判断。
1. 由蛋白翻译后修饰造成的多条带现象
TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells-2) 是一种细胞表面的受体糖蛋白，理论分子量约为 25 kDa。成熟 TREM2 包括一个 V-type Ig-like 胞外区域，一个跨膜区和一个短的胞质区。可溶形式的 TREM2 ECD 是由选择性剪接或蛋白水解产生，而细胞质区域可以通过酶裂解而释放。通过 Uniprot 数据库发现 TREM2 有 2 个糖基化位点，文献中 TREM2 呈现多条带且大于理论分子量，故推测为糖基化的 TREM2。
图片来源：Uniprot
WB 检测 THP-1 细胞裂解物中人 TREM2 的表达。用 0.2 μg/mL 山羊抗人 TREM2 抗原亲和纯化的多克隆抗体 (Human TREM2 Antibody,货号 AF1828) 和 HRP 标记的抗山羊 IgG 二抗 (货号 HAF109) 检测 PVDF 膜。在约 28 kDa 及以上的位置检测到多个条带（本实验在还原条件下，使用免疫印迹缓冲液 1 组）。
因此，如需在天然样品中检测未被糖基化的 TREM2，可尝试去糖基化实验，使用去糖基化试剂盒或使用 PNGase enzymes (Catalog # 9586-GH,9109-GH,7695-GHP)。后续排除非特异条带的干扰，可做只孵育二抗的阴性对照，更换封闭液（如将 BSA 换为脱脂牛奶），或者尝试 IP 实验。
2. 目的蛋白被酶切后产生不同亚型，造成多条带现象
Brevican（也称为 BEHAB）是属于 lectican 家族的蛋白聚糖。Brevican 存在于中枢神经系统，由星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元表达。其中心 (GAG) 区域后端被截短，形成一个 GPI 锚定的剪接体。此外 Brevican 还可被多种蛋白酶水解，形成许多不同的短片段。如下图所示，在天然健康样品中可检测到两条带，推测为 Brevican 被蛋白酶裂解后的产物，约为 60 kD 和 90 kD。
WB 检测人小脑组织和人脑运动皮层组织的裂解物中 Brevican 的表达。用 0.1 g/mL 绵羊抗人/大鼠 Brevican 多克隆抗体 (货号 AF4009) 和 HRP 标记的驴抗绵羊 IgG 多克隆抗体 (货号 HAF016) 检测 PVDF 膜。在大约 60 kDa 和 90 kDa 检测到 Brevican 的特异性条带（本实验在还原条件下，使用免疫印迹缓冲液组 1）。
高背景，条带去污小妙招
有时目的条带已隐约可见，但背景较深（如下图），这种情况虽也是实验操作或试剂造成，可能为膜的空白处与一抗或二抗结合、封闭剂未充分溶解、HRP 聚集等，但与非特异条带相比，容易改善，下面即为造成 WB 高背景的原因及改善方式。
又如：
1. 封闭时间不足
改善方式：增加封闭时间和/或温度，增加封闭剂的浓度（尝试增加至 10%），更改封闭剂（脱脂牛奶或 BSA），在抗体缓冲液中加入封闭剂（也可增加封闭剂浓度）。
2. 使用了错误的封闭剂
当检测磷酸化蛋白时，不推荐用脱脂牛奶作为封闭剂，因为牛奶和酪蛋白中富含磷酸化蛋白。
3. 抗体浓度偏高，导致非特异性结合
改善方式：降低一抗或二抗的浓度，在抗体缓冲液中加入封闭剂，做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。
4. 清洗次数不足，非结合抗体未完全洗净
需要增加洗膜次数和/或洗膜时间。
5. 膜在实验过程中风干
确保膜在 WB 实验过程中不会变干。
6. 曝光时间过长
降低曝光时间，设置不同的检测时间点，逐步曝光。
7. 检测试剂太灵敏
在纯水中稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂。
除此之外，对于 R&D Systems 品牌验证过 WB 的抗体，通常会在产品页面给出检测体系建议，避免客户使用不合适的体系导致非特异条带和高背景。
Bio-Techne 旗下子品牌 R&D Systems 和 Novus Biologicals 拥有 10w+ 种一抗，在研发过程中，选择活性蛋白作为免疫原，经过严格的抗体验证。其中，经过基因敲除 (KO) 验证的 WB 抗体就将近 3000 种，极大地保障了抗体的特异性和实验的可重复性。
KO 验证的 WB 抗体产品列表（部分）
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图文来源：Bio-Techne
题图来源：图虫创意
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