NBT | 2.0版Slide-seq：实现高灵敏度近细胞分辨率空间转录组分析

撰文 | Volibear

责编 | 兮

自2009年诞生以来【1】，单细胞测序技术在鉴定新的细胞类型，探索动态发育过程，鉴定基因调控机制，揭示随机等位基因表达等方面显示出巨大的优势，但是它也因为无法获取细胞空间分布信息而限制了其进一步的应用【2】。为了弥补这一缺陷，2019年Broad研究所Evan Z Macosko和Fei Chen在Science发表了文章Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution，开发了基于测序的空间转录组技术——Slide-seq【3】，这种技术并不需要专门的成像设备，不仅可以揭示组织中存在哪些细胞类型，而且还能揭示他们的空间位置和功能，从而可以为科学家们提供前所未有的丰富的组织功能图谱，但是它的缺陷也很明显，即转录本检测灵敏度相对较低，这也限制了该技术在生物学问题上的应用。

2020年12月7日，Fei Chen和Evan Z Macosko合作在Nature Biotechnology期刊上发表文章Highly sensitive spatial transcriptomics at near-cellular resolution with Slide-seqV2，开发出了这项技术的2.0版本，命名为Slide-seqV2。在该项研究中，研究人员改进了上个版本中的文库生成，磁珠合成和阵列索引等步骤，使RNA捕获效率达到单细胞RNA-seq数据的约50％（比上一代Slide-seq约高10倍），接近基于液滴的单细胞RNA-seq（Droplet-based single-cell RNA-seq）技术的检测效率。在多个实用场景下的验证表明，近细胞分辨率和高转录本检测效率的结合使Slide-seqV2在许多实验中都是利器。

在上一代的Slide-seq技术中，研究人员将新鲜冷冻组织切片转移到覆盖着独特DNA条形码的珠子表面上，并进行组织溶解，从而让mRNA转录物与覆盖着DNA条形码的珠子结合。随后对条形码RNA文库进行测序，然后由特定算法为每个测序片段分配位置，对这些位置进行绘制就可产生高分辨率的细胞类型或基因表达图谱。为了提高该技术对于转录本的检测灵敏度，作者分别从三个方面对这项技术进行了改进：1. 带有barcode珠的合成2. 阵列测序的流程3. cDNA的酶法处理。具体来讲，首先，作者开发了一种使用单碱基编码方案对barcode珠阵列进行空间索引的新策略，该方法通过边连接边测序，并使用偏移引物进行顺序询问。这种方法的优势在于，更方便使用已经商业化的测序仪器，再加上作者改进了barcode珠的合成方法，使得该珠子有了优于上一代的性能，这样的策略一起就使得从测序仪上能够更有效地读出Slide-seqV2阵列上的基因表达数据。

其次，作者优化了Slide-seqV2酶促文库的制备步骤。在作者的假定之中，由于组织在逆转录过程中存在抑制作用，因此为全转录组扩增添加3'引发位点的模板转换反应效率低下。因此，作者在逆转录后增加了另一条第二链合成步骤，以增加可通过PCR扩增的cDNA的数量。事实证明作者的假定是对的，与原始的Slide-seq方法相比，12.5天小鼠胚胎上进行Slide-seqV2的转录，每珠获得的转录本比原始Slide-seq版本多了约9.3倍。同样，在成年小鼠海马体中，作者也观察到了类似的改进。

Slide-seq技术概览

接下来，研究人员试图量化Slide-seqV2相对于其他测量细胞和组织中RNA含量的分子技术的绝对灵敏度。作者比较了通过以下方法测量的相同数量细胞中CA1标记基因（Atp2b1，Ocaid2和Slc17a7）的计数：（1）Slide-seqV2，（2）Drop-seq，（3）单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization，smFISH）。作者发现，与测得的三个基因的Drop-seq数据相比，Slide-seqV2与smFISH的数据模式相似。为了更全面地描述Slide-seqV2的灵敏度，作者将Drop-seq中在CA1兴奋性神经元中检测到的所有基因的每个基因的总UMI（unique molecular identifiers, UMIs）计数与在Slide-seqV2中按面积计算的等效CA1细胞的UMI进行了比较，Slide-seqV2检测到大约为Drop-seq计数的44％±26％，这表明Slide-seqV2的对转录本的捕获效率接近现代单细胞测序技术。而且Slide-seqV2在不同重复之间具有很好的重现性，这一点要优于传统的单细胞测序技术。作者在不同的生物学问题中使用了该技术，先是利用Slide-seqV2揭示了树突富集mRNA的空间模式，而这一问题的揭示需要对转录本有更高的捕获灵敏度。作者还通过该技术建立了发育中的小鼠皮质的空间发育轨迹，有可能会为未来的疾病诊断和治疗提供依据，这项技术为我们描述了广泛的应用场景。

总之，升级版的Slide-seqV2相较于上一代有着更强的转录本检测能力，更高的灵敏度，其应用场景也更加广阔，将为我们理解个体发育、疾病发生等问题提供有力的支撑。

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0739-1

参考文献

1.Tang, F., et al., mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. 2009. 6(5): p. 377-382.

2.Kolodziejczyk, A.A., et al., The technology and biology of single-cell RNA sequencing. 2015. 58(4): p. 610-620.

3.Rodriques, S.G., et al., Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. 2019. 363(6434): p. 1463-1467.

制版人：Kira