抗癌靶点XPO1「图鉴」

　　核输出蛋白1（exportin 1,XPO1）又称染色体区域稳定蛋白1，通过调节从细胞核到细胞质的一系列“货物”（包括蛋白质和几种RNA）的输出，在维持细胞内稳态中起着至关重要的作用。这种蛋白的失调在各种实体和血液恶性肿瘤的发展中起着关键作用。此外，XPO1与多种标准的治疗方法（包括化疗和靶向治疗）的耐药性有关，使其成为新型癌症疗法的一个有吸引力的靶点。

　　多年来，一些选择性的核输出蛋白抑制剂已被开发出来。然而，只有selinexor已经过临床验证。来自临床试验的数据已促使XPO1抑制剂selinexor被批准作为多发性骨髓瘤（MM）的五线疗法（与地塞米松联用）和复发和/或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的单药疗法。

　　11月10日，一篇发表在Nature Reviews Clinical Oncology的综述总结了核输出蛋白XPO1抑制剂的进展和挑战，并讨论了新兴的联合疗法和生物反应标志物的潜力。

　　来源：Nature Reviews Clinical Oncology

　　XPO1介导核输出

　　真核细胞主要通过核膜限制不同信号蛋白和转录因子的进入来保护染色体。较小的分子（<40 kDa）可以通过核孔复合体经简单扩散进入和离开细胞核；然而，较大的蛋白质、RNA和其他生物单元需要专门载体介导的能量依赖性主动转运，在GTPase Ran（Ras相关核蛋白，也称RanGTP）的帮助下进行。

　　大多数具有核转运特殊功能的蛋白质是核转运蛋白家族的成员。输入蛋白和输出蛋白是两个主要亚家族。到目前为止，已经鉴定出10多种不同的输入蛋白和7种不同的输出蛋白。其中4个输入和1个输出蛋白（XPO1）通过识别特定信号发挥作用，分别为带正电的核定位信号（NLS）和富含亮氨酸的疏水核输出信号（NES）。

　　在输出蛋白中，只有XPO1负责运输含NES的核蛋白如p53、RB1和p27（图1）。XPO1在癌症患者（包括胰腺癌、胃癌、前列腺癌和结直肠癌患者）中过度表达，其与疾病进展、治疗耐药、较差的总生存期（OS）或无进展生存期（PFS）有关。这些观察结果表明XPO1作为癌症治疗靶点具有相当大的价值（图1）。

　　图1. XPO1介导的核输出示意图。（来源：Nature Reviews Clinical Oncology）

　　详细来说，XPO1属于核转运蛋白的importin-β超家族，能将至少221种含NES的蛋白质和一部分细胞核RNA排出到细胞质。XPO1可识别货物分子上的保守疏水性NES。含有NES的蛋白质能够调节XPO1介导的mRNA和核小RNA的输出（尽管该过程可能还需要其他的衔接蛋白）。一旦转运，XPO1促进调节蛋白的细胞质定位，包括肿瘤抑制因子p53、CDK1、结肠腺瘤性息肉病蛋白（APC）、BRCA1和BRCA2、survivin、核仁磷酸化蛋白（nucleophosmin, NPM）和forkhead box转录因子家族成员等（图2）。

　　图2. XPO1介导的核输出及其致癌机制。（来源：Nature Reviews Clinical Oncology）

　　XPO1作为治疗靶点

　　核输入和输出都受到核转运蛋白的严格控制，从而凸显了这些蛋白质作为各种疾病包括癌症治疗靶点的重要性。与非恶性肿瘤细胞相比，癌细胞更容易受到核转运的抑制，这主要是因为它们具有较高的细胞增殖和代谢率。因此，抑制核转运单药疗法或结合标准护理疗法，可能是治疗晚期恶性肿瘤的一种有前途的方法。

　　核输出的抑制作用最初是在临床前用诸如来普霉素B 、anguinomycins和ratjadones等抗生素进行研究的。然而，这些药物逐渐被小分子输出蛋白抑制剂所取代，如混杂的天然药物，包括goniothalamin、valtrate或姜黄素；或合成药物，如选择性XPO1抑制剂selinexor、eltanexor、verdinexor 和felezonexor。

　　20世纪90年代Nishi等人发现了第一种XPO1特异性抑制剂来普霉素B，这种抗生素与XPO1的Cys528共价结合，是XPO1与NES相互作用的不可逆抑制剂。由于对XPO1具有很强的特异性，来普霉素B进行了治疗难治性癌症患者的I期试验。然而，由于出现了严重的全身毒性（不可逆地阻断了恶性和非恶性细胞的核输出），包括恶心和呕吐、严重的厌食和不适（即使是低剂量），这些试验被中止。

　　接下来，许多来普霉素B类似物被开发出来，包括来普霉素A、anguinomycin A/B/C/D和ratjadones A/C，然而这些药物迄今为止仅显示出有限的治疗潜力。Felezonexor已被证明通过与Cys528共价结合以及诱导XPO1降解来抑制核输出。与来普霉素B不同，felezonexor是XPO1的可逆抑制剂，因此预期不良事件较少。目前正在进行涉及该药物的I期剂量递增研究（NCT02667873），预计将于2021年完成。

　　在来普霉素B和相关化合物的早期失败后，研究人员使用基于共识诱导配合对接（consensus-induced fit docking, cIFD）结构的药物开发方法来最小化XPO1结合口袋中的相互作用点数量。这一策略为开发新型小分子XPO1抑制剂——选择性核输出抑制剂（SINE）铺平了道路。

　　SINE化合物包括KPT-185、KPT-251、KPT-276、selinexor、eltanexor 和 verdinexor，所有这些都是口服生物可利用的高选择性XPO1抑制剂。与来普霉素B类似，这些抑制剂与XPO1的NES结合口袋中的Cys528共价相互作用。然而，SINE化合物的可水解烯酮基团与远离XPO1碱基残基的区域结合，使这些药物成为缓慢可逆抑制剂，这有助于更好的体内耐受性。例如，KPT-185 40%–60%的抑制和结合活性在24小时后被逆转。因此，SINE化合物与XPO1结合足够长的时间以诱导癌细胞死亡，同时也允许一定程度的核输出，使非恶性细胞能够继续发挥功能或至少存活。基于多个临床试验的数据，SINE化合物 selinesor已获得FDA批准用于两种恶性肿瘤：MM和DLBCL。

　　图3. XPO1生物学和临床前/临床靶向研究主要进展的时间线。与XPO1生物学相关的里程碑发现显示在橄榄绿方框中，XPO1抑制剂在临床前/临床中的发现显示在浅橙色方框中，SINE化合物selinexor的主要批准显示在紫色方框中。ALL=急性淋巴细胞白血病；AML=急性髓系白血病；DLBCL=弥漫性大B细胞淋巴瘤；NES=核输出信号；snRNP= small nuclear ribonucleoprotein；SINE=选择性核输出抑制剂。（来源：Nature Reviews Clinical Oncology）

　　XPO1在耐药性中的作用

　　耐药是癌症患者长期存在的问题，可以说是治疗的首要障碍。在大多数患者中，对一种或多种化疗和/或靶向治疗的初始应答通常在数月至数年内失败，这是由于通过多种不同机制产生了耐药性。一些可能部分或完全导致耐药性的机制已经被鉴定，过去10年来的发现证明XPO1在肿瘤耐药性发展中起着关键作用（图4）。

　　涉及乳腺癌细胞系的研究表明XPO1与多种药物靶点、肿瘤抑制因子和参与细胞周期调控的蛋白质的输出密切相关。例如，XPO1介导的BRCA1过度输出被证明可抑制治疗诱导的这些细胞的凋亡。XPO1还可以输出肿瘤抑制蛋白，如结肠癌和其他类型癌症中的APC和p53，以及慢性髓性白血病细胞中的致癌融合蛋白BCR-ABL1。特异性蛋白的异常核或胞浆定位可影响肿瘤的侵袭性、转移倾向、疾病复发和治疗抵抗，所有这些都会影响患者的预后。肿瘤抑制蛋白的错误定位可能具有促进肿瘤生长的作用，对某些治疗的反应至关重要。因此，抑制XPO1是一种机制上独特的策略，它有潜力克服多种形式的抗癌药物耐药性，特别是在开发出已在多个临床试验中得到评估并且没有与来普霉素B相关耐受性问题的SINE化合物之后。

　　许多癌症的耐药性涉及药物代谢导致的化学失活、改变的DNA修复、药物外排系统的激活、药物靶点和/或靶点的修饰，以及药物靶点、肿瘤抑制因子或与细胞增殖相关的蛋白质的胞内错定位等。过度的核输出会促进癌症和治疗耐药性的发展。一些研究数据发现，SINE化合物有助于克服硼替佐米、Anthracycline、伊布替尼、吉非替尼、仑伐替尼、顺铂、吉西他滨等的耐药性。

　　图4. XPO1在获得性耐药中的作用。

　　过度的核输出是癌症发生和发展的一个因素，并与化疗耐药有关。增强的XPO1活性导致肿瘤抑制蛋白（TSP）如p53的胞质滞留。这些蛋白质的错误定位导致其功能失活，从而获得治疗耐药。XPO1过表达还可以促进转录延长因子E2F7在某些癌症类型（如头颈部鳞状细胞癌）中的输出，由于细胞质中SphK2的抑制，从而导致anthracycline耐药。

　　同样，增加ATP依赖性RNA解旋酶DDX17和拓扑异构酶2α（TOP2A）的输出可分别对吉非替尼或阿霉素产生耐药性。核输出NF-κB信号通路的重要成员，如NF-κB、p65和p50的抑制剂，可激活该通路并导致伊布替尼耐药。

　　顺铂化合物的耐药性也与通过XPO1的核输出有关。一项机制研究表明，细胞质中的galectin 3调节β-catenin并诱导对顺铂类药物的耐药性。核galectin3向细胞质的输出增强了这种调节，随后促进了对顺铂类化合物的耐药。

　　p53、蛋白磷酸酶2A（PP2A）等的核输出也与酪氨酸激酶抑制剂，尤其是伊马替尼或新型PI3K抑制剂CYH33的耐药性有关。（来源：Nature Reviews Clinical Oncology）

　　XPO1抑制剂的临床应用

　　目前许多selinexor临床试验正在进行中。selinexor在大量预先治疗过的血液系统恶性肿瘤患者中显示出很有前景的抗肿瘤活性：

　　多发性骨髓瘤MM

　　MM患者的护理标准治疗药物主要分为3类，分别为蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米和卡非佐米）、免疫调节药物（如来那度胺和泊马度胺）以及靶向CD38的单克隆抗体（如达雷妥尤单抗）。几乎所有的MM患者最终都会对这些药物产生耐药性。因此，迫切需要一种新的MM疗法，其作用机制与目前的护理治疗标准有根本不同。在这点上，用selinexor靶向核输出被认为是一种很有前途的治疗方法。相关临床数据见下表：

　　2019年7月，基于这些研究结果，selinexor加低剂量地塞米松最终获FDA加速批准用于对至少4种治疗方法无效的MM患者。此外，EMA目前正在考虑selinexor加低剂量地塞米松作为加速评估的候选方案。

　　非霍奇金淋巴瘤

　　在霍奇金淋巴瘤患者中使用维布妥昔单抗和PD-L1抗体观察到的预后改善尚未在非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者中得到复制，因此该疾病需要新的治疗方法。涉及selinexor的NHL和DLBCL部分临床试验数据如下表所示：

　　其中，来自IIb期SADAL研究的数据表明，接受selinexor单药治疗的DLBCL患者具有持久的临床益处。在127例重度预先治疗过的DLBCL患者中，ORR为28%，包括12%的完全缓解。根据这项单臂研究数据，FDA在2020年6月批准selinexor用于患有复发性和/或难治性DLBCL的成年患者，这些患者之前至少接受了两种系统性治疗。

　　selinexor联合利妥昔单抗和环磷酰胺、多柔比星、长春新碱以及泼尼松化疗（R-CHOP）的有效性和安全性正在一项II期试验（NCT03147885）中进行评估，目前在招募患者。此外，目前正在对DLBCL患者进行评估的其他组合包括利妥昔单抗联合吉西他滨、地塞米松和顺铂，加/不加selinexor（NCT04442022），以及selinexor加维奈克拉治疗包括DLBCL在内的几种高危血液系统恶性肿瘤之一的患者（NCT03955783）。

　　急性髓系白血病

　　部分selinexor在急性髓系白血病（AML）患者中的临床试验数据如下表所示：

　　其中，selinexor单药治疗的安全性和耐受性是在一项涉及95例复发和/或难治性AML患者的I期剂量递增研究（NCT01607892）中确定的。

　　有趣的是，在CML 和AML小鼠模型中，第二代SINE化合物eltanexor对肿瘤负荷和生存率的影响与selinexor的作用相似。而且由于中枢神经系统的渗透水平大幅降低，因此它的耐受性可能更好。eltanexor目前正在对复发和/或难治性MM、结直肠癌、去势抵抗前列腺癌或高危骨髓增生异常综合征的患者进行试验（NCT02649790）。

　　实体瘤

　　血液系统恶性肿瘤，selinexor用于晚期实体瘤患者治疗的早期试验也在开展。

　　一项评估selinexor的安全性和初步疗效的大型队列I期涉及189例各种晚期实体瘤（包括结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和黑色素瘤）患者。研究人员得出结论，在推荐的II期剂量（35 mg/m2，每周两次）下，selinexor是安全且耐受性良好的。45例患者中有1例在这个剂量下出现剂量限制性恶心、呕吐和疲劳。在157例可评价疗效的患者中，1例完全缓解，6例部分缓解（ORR 4%），另有27例（17%）病情稳定≥4个月。总的来说，selinexor单药疗法似乎对实体瘤患者有足够的耐受性，尽管目前仍在等待更确切的疗效数据。

　　新型生物标志物

　　XPO1表达与MM患者的不良预后呈正相关。特别是XPO1的过度表达似乎与硼替佐米的耐药性和较短的生存期有关。此外，新的证据表明XPO1E571K突变导致错义替换，在多种癌症的发生过程中起着重要作用。

　　XPO1E571K已在几种不同的血液系统恶性肿瘤中被检测到，包括原发纵隔DLBCL、经典霍奇金淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤、纵隔灰区淋巴瘤和食管鳞状细胞癌。重要的是，这种改变可以用分子方法检测，如数字化PCR和下一代测序技术，且无论是在肿瘤活检样本中，还是在血液来源的游离细胞DNA中，都可以检测到。一项回顾性研究显示XPO1E571K可在25%的经典霍奇金淋巴瘤患者中被检测到。这种变异存在于游离细胞DNA中，似乎与PFS持续时间较短有关，并有可能作为一种预后生物标志物。

　　XPO1E571K也可能与其他类型的淋巴瘤有关。例如，大约50%原发性骨髓淋巴瘤患者具有明显可检测到的XPO1E571生物标记分子特征。此外，这种改变与PFS持续时间较短有关。在CLL患者中，XPO1E571K有类似的预后相关性，尽管其在CLL患者中的比例要低得多。XPO1E571K可能还适用于其他癌症。

　　新兴组合

　　临床和临床前研究正在评估selinexor与标准护理疗法，包括其他靶向药物的组合，以期克服获得性耐药并改善治疗结果。

　　Selinesor联合地塞米松作为MM患者的第五线疗法已经获得FDA的加速批准。此外，其他与铂类药物（如顺铂和卡铂）和taxanes（如紫杉醇）的联合用药目前正在进行临床研究（NCT04442022 和 NCT02419495）。在AML患者中，拓扑异构酶2α的异常胞浆定位与拓扑异构酶抑制剂的耐药性有关。两种拓扑异构酶2α抑制剂——去伊达比星和多柔比星已被证明与selinexor联用时可协同抑制体外AML细胞生长，及小鼠体内异种移植物的生长。

　　在p53野生型和p53突变细胞系以及AML患者原代细胞中，除selinsor外，另一种SINE化合物（KPT-185）已被证明与MDM2抑制剂nutlin 3a具有协同作用。AML细胞系体外研究表明，当与selinexor联合使用时，地西他滨的体外效力显著增强。这种联合疗法的抗白血病作用也在AML小鼠模型中得到了验证。此外，基于CRISPR基因敲除筛查发现XPO1是一个关键靶点，可能有助于克服AML患者对FLT3抑制剂的耐药性。这项研究证明了selinexor与米哚妥林或吉瑞替尼在AML细胞系和患者源性细胞中的协同作用。

　　BTKC481S突变显著降低了伊布替尼的疗效。Selinexor已被证明可以使对伊布替尼耐药的患者来源的原代CLL细胞变得对治疗再次敏感，在小鼠模型中也发现了类似的协同效应。这些临床前的数据表明，selinexor可以绕过BTKC481S引起的伊布替尼耐药性。伊布替尼对BTK的部分抑制与selinexor间接下调BTK表达协同促进肿瘤细胞死亡。

　　在淋巴瘤临床前模型中，selinexor也被证明与地塞米松和依维莫司有协同作用。此外，selinesor在黑色素瘤和结肠癌的实验模型中显示了与免疫检查点抑制剂相结合的抗肿瘤作用。在黑色素瘤和结肠癌的同基因小鼠模型中，分别使用Selinesor和免疫检查点抑制剂来评估XPO1和PD-1或其配体PD-L1的双重抑制作用。这一组合不仅显示了肿瘤抑制方面的作用，而且表现出实质性的免疫调节功能，包括某些表型的免疫细胞类型的变化，如自然杀伤细胞和活化的T细胞。这些观察结果表明，值得进一步临床研究XPO1抑制和抗PD-1/PD-L1抗体的组合。Selinexor还可能与Bcl-xL抑制剂A-1331852协同作用，通过抑制核糖体RNA处理和由此导致的MCL1蛋白异常合成，诱导A549、HeLa、U87、U118 和U251等多种癌细胞系的凋亡性细胞死亡。

　　小结

　　由于XPO1在核输出中的中心作用与调节大多数癌症特征的能力有关，以及这种蛋白相对于其他癌症药物靶点的独特特性，一些XPO1抑制剂已经被合成，并在多个临床环境中进行了测试。

　　尽管对疗效和安全性之间的平衡存在一定的担忧，XPO1抑制剂仍然是一种很有前途的策略，与各种药物联合使用可能更有效，包括吉西他滨、蒽环类药物、mTOR抑制剂、伊布替尼或免疫检查点抑制剂。SINE化合物与其他靶向疗法或细胞毒性药物结合有望克服标准护理疗法的一些形式的获得性耐药。XPO1抑制剂增强各种药物的抗肿瘤活性在临床前模型中很明显，目前正在进行大量试验。此外，其他旨在识别可能的生物标志物的研究也值得关注，因为可能有助于找到对XPO1抑制特别敏感的肿瘤患者。

　　参考资料：

　　Asfar S. Azmi et al. The nuclear export protein XPO1 — from biology to targeted therapy. Nature Reviews Clinical Oncology (2020).