非靶向代谢组学对赤霞珠果皮不同砧穗组合差异代谢物的分析

位于中国西北部的新疆因拥有非常适宜酿酒葡萄种植的光热资源，酿酒葡萄产业蓬勃发展，种植面积和产量稳居全国前列，但是新疆地域广袤，气候多样，干旱、盐碱、寒冷等生态条件严重限制了酿酒葡萄的进一步发展。很多研究发现适宜的砧穗组合不仅可以调控酿酒葡萄的长势、物候期和产量，还影响酿酒葡萄的果实品质如糖、酸、单宁、花色苷、白藜芦醇及香气等，甚至对葡萄酒的质量及颜色、口感等感官特性产生影响。但目前砧木对接穗的影响多集中在生长发育和果实品质方面，而砧木对接穗葡萄果实中代谢物及其相关代谢过程、代谢途径的影响还鲜见报道。

代谢组学是基于高通量、多变量数据，对生物体中的小分子代谢物成分进行分析和数据整合的研究方式，近些年发展迅速，其中非靶标代谢组学是无偏向性地分析样品中尽可能广泛的代谢产物，已经在生物学、临床医学、药学、食品等生命科学领域广泛应用。代谢组学为分析植物品种及栽培方法对植物代谢物质及其代谢通路的影响提供了方法。

石河子大学农学院（特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室）的章智钧、刘怀锋和赵宝龙*等人利用基于液相色谱- 质谱（LC-MS）联用技术的非靶向代谢组学，分析不同砧穗组合酿酒葡萄主栽品种‘赤霞珠’果皮代谢物质，经过包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLSDA）等多元统计分析方法，筛选不同砧穗组合葡萄代谢产物的差异并分析其相关通路，探究代谢物对葡萄品质影响，以期为葡萄砧穗组合的选择提供理论依据，为优质葡萄砧木的选育提供指导。

1 不同砧穗组合‘赤霞珠’葡萄果实成熟指标

从葡萄果实完全转色开始对葡萄成熟指标进行监控，9月25日各处理葡萄果实中可溶性糖含量均达到200 mg/g且相对稳定。采样后对葡萄中可溶性糖及可滴定酸进行测定，结果显示，各组处理葡萄果实中可溶性糖及可滴定酸含量略有不同，但均无显著性差异（P＞0.05），各组处理葡萄果实达到相近的成熟度。

2 样本分析

QC工作是进行基于质谱技术的代谢组学研究时获得可靠且高质量的代谢组学数据的基础。由图1可以看出，QC样品总离子流图重复性好，峰分离度高，同时由图2可发现，QC样本相对于实验样本聚集，且QC误差小于2 倍的标准偏差以内，说明本实验LC-MS检测的系统误差在可控范围内。

3 不同砧穗组合‘赤霞珠’葡萄果皮代谢组差异

3.1 PCA

不同砧穗组合‘赤霞珠’葡萄果皮的代谢产物PCA得分图见图3。如图3所示，CS/1103P和CS/140R两组点分别单独在第1象限（t[1]＞0，t[2]＞0）和第3象限（t[1]＜0，t[2]＜0），表明这两种砧穗组合果皮中代谢物间有显著差异，代谢模式都与其他砧穗组合代谢模式不同。CS/5C与CS/SO4两组样品点距离较近，CS/3309C与CS对照组两组样品点有部分重叠，说明CS/5C与CS/SO4、CS/3309C与CS砧穗组合果皮中代谢物间没有显著差异。

3.2 PLS-DA

本研究通过PLS-DA对不同砧穗组合的代谢信息进行进一步的分析。不同砧穗组合葡萄果皮样本PLS-DA得分图和置换检验结果如图4所示，其结果与PCA相似。不同砧穗组合葡萄果皮样本的模型系数Q2为0.942、R2Y为0.995，表明模型预测能力高，模型的拟合度较好。在置换检验中模型Q2点从左到右均远低于最右端的原始Q2点，且位于最右边的R2和Q2值均超过0.9，Q2回归线的截距为-0.479，说明模型具有较好的预测能力并且有效可用。

3.3 OPLS-DA

OPLS-DA是代谢组学数据分析中常用的分析方法，是PLS-DA的扩展。图5为OPLS-DA得分图，该结果与PCA结果大体一致。不同砧穗组合葡萄果皮模型参数中R2X＝0.625，说明该模型对自变量X的解释程度为62.5%；R2Y＝0.992，表示对分类变量Y的解释程度为99.2%；Q2＝0.932，说明该模型对样本变量的预测程度为93.2%，不同砧穗组合葡萄果皮代谢影响模型对自变量X的解释程度为54.5%；对分类变量Y的解释程度为99.5%；对样本变量的预测程度为86.5%，结果显示OPLS-DA模型稳定性良好且预测能力较强。其中CS/140R和CS/5C样本在PCA和PLS-DA中均没有分离开，在OPLS-DA中基本分离开，表明OPLS-DA的效果更好。而CS与CS/3309C Skin样本在PCA、PLS-DA和OPLS-DA均未分离，说明CS与CS/3309C组合在葡萄果皮中代谢模式非常相近。

4 差异代谢物的筛选与鉴定

通过OPLS-DA模型的第1主成分变量重要性值投影（VIP）＞1且t检验的P≤0.05结合一维方差分析（one-way ANOVA P-value）不高于0.05，寻找差异代谢物并鉴定结果，不同砧穗组合葡萄果皮中显著差异代谢物有32 个。

5 差异代谢物热图分析

采用聚类分析和热图分析方法对不同砧穗葡萄果皮中的差异代谢产物进行分析，结果见图6。图中颜色表示含量，红色表示含量高表达，绿色表示含量低表达，通过对鉴定的代谢物进行聚类分析后，从图中条带可以看出葡萄果皮中都有明确的高表达或者低表达的区域，可以根据表达情况区分每组处理。

在果皮中，CS中2-酮戊二酸、乙基阿特拉津、葡萄糖酸、L-苏氨酸、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、L-缬氨酸、苹果酸、异槲皮苷高于其他组合，在CS/1103P中D-焦谷氨酸、2-脱氧-α-D-吡喃核糖、儿茶素、甘油磷酸胆碱、牛磺酸高于其他组合，在CS/SO4中1-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)己吡喃糖、γ-氨基丁酸、紫云英苷、锦葵色素-3-(6-对咖啡糖苷)、锦葵色素-3-(6-对香豆素苷)、芍药苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、矮牵牛苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、二萜内酯高于其他组合，在CS/140R中没食子酸酯、L-精氨酸、连翘苷-3-半乳糖苷、酪氨酸高于其他组合，在CS/5C中亮氨酸高于其他组合，在CS/3309C样本中香豆酸、柠檬酸、飞燕草素-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、赖氨酸、锦葵花素-3-葡萄糖苷高于其他组合。由此可见，不同砧木对果皮中代谢物种类和含量均有差异。

6 代谢产物代谢途径分析

代谢途径的分析是依托KEGG代谢途径数据库采用通路分析（MetPA）通过拓扑分析，识别出可能受不同砧穗组合影响的代谢通路。图7为不同砧穗组合葡萄果皮代谢通路影响因子图，图中每个圆点代表一个代谢通路，纵坐标为-lgP表示富集到通路中代谢物的显著性，从低到高显著性依次增加同时颜色越深。横坐标从0～1代表差异代谢物对通路的影响值，值越大影响越大、圆圈越大。

结果显示，在葡萄果皮中受不同砧穗组合扰动的代谢途径主要是异喹啉生物碱生物合成、黄酮和黄酮醇合成、泛酸和辅酶A生物合成、柠檬酸循环等21 个通路。

7 差异代谢物的分析

2-酮戊二酸是柠檬酸循环、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、赖氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸盐代谢、丁酸代谢的组成部分，结果显示，在果皮中各砧穗组合相比CS均不同程度降低了2-酮戊二酸含量，嫁接后可能会降低氨基酸的合成及碳水化合物的合成。柠檬酸与苹果酸是葡萄中重要的有机酸，本研究中CS/SO4和CS/5C砧穗组合极显著降低了葡萄皮中柠檬酸的含量，CS/SO4、CS/140R、CS/5C和CS/3309C砧穗组合极显著降低了葡萄果皮中苹果酸的含量。可见，嫁接可以改变葡萄果皮中有机酸的含量。

本研究发现，CS/1103P砧穗组合显著提高了葡萄果皮中儿茶素含量，CS/140R砧穗组合极显著提高了葡萄果皮中没食子酸盐含量，CS/SO4、CS/140R、CS/5C和CS/3309C极显著提高了紫云英苷含量。本研究中，CS/SO4砧穗组合不同程度提高了连翘苷-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-(6-对香豆素苷)、矮牵牛苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、芍药苷-3-(6-乙酰葡萄糖苷)、锦葵色素-3-(6-对咖啡糖苷)的含量。通过不同砧穗组合可以砧穗组合可改变葡萄果皮中多酚类物质的含量，其机制需进一步挖掘。

不同砧穗组合可以提高葡萄果皮中有机酸及多酚类物质的含量，甚至可以根据不同用途通过选择不同砧穗组合从多方面改变葡萄果皮中成分，从而改善相关产品的口感、营养特性甚至是功效。

结 论

本研究使用LC-MS非靶向代谢组学分析方法，研究了5 种嫁接砧穗组合和CS自砧嫁接葡萄果皮中32 种差异代谢物，并对差异代谢物进行了通路富集分析，筛选出了6 种砧穗组合葡萄果皮中差异显著的代谢途径。发现适当的砧穗组合可以通过影响异喹啉生物碱生物合成、黄酮及黄酮醇合成、泛酸和辅酶A生物合成、柠檬酸循环等代谢途径，改变葡萄果皮代谢物质含量。不同砧穗组合可以调节葡萄果皮中有机酸、多酚类物质的含量，提高葡萄品质，改善相关产品的口感、营养特性甚至是功效。

本实验成功鉴定出了赤霞珠葡萄6 种砧穗组合的特征标志物，揭示了赤霞珠葡萄砧木对接穗影响的代谢机制，为葡萄砧穗组合的选择提供理论依据，并为葡萄砧木的良种选育提供了方向，为改良以葡萄为原料的相关产品质量提供了重要启示。

本文《非靶向代谢组学对赤霞珠果皮不同砧穗组合差异代谢物的分析》来源于《食品科学》2020年41卷24期22-30页，作者：章智钧，刘怀锋，孙军利，赵宝龙，潘立忠，何旺，刘晶晶。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190617-172。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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