高通量测序分析赤水晒醋各生产阶段微生物群落结构变化

赤水晒醋是贵州省赤水市生产的一种具有典型地方特色的优质食醋产品，由多种中药材制作成药曲和大米、糯米、麸皮发酵生产而成。赤水晒醋最显著的特点便是“晒”，独特的醋醅曝晒阶段可以促进醋液中风味物质积累，其次是以药制曲的工艺，在制曲过程中加入108 种中草药粉成分，使晒醋不但具有很高的食用价值，还兼有一定的药用作用。晒醋醋曲的制作是在自然条件下进行的，包含了各种微生物的生长，由于中草药本身具有抑菌、抗氧化等生物活性，既能保持赤水晒醋的独特风味，防止产生异味，又可以促进霉菌等的生长，提高醋曲的品质，从而形成赤水晒醋独具特色的风味特征。

现代生物技术的高速发展带来了高通量测序和变性梯度凝胶电泳（DGGE）等技术在食醋发酵中微生物群落测定的应用，以至于有越来越多对发酵食品的微生物组成、发酵过程中的变化以及功能的研究。贵州大学（贵州省发酵工程与生物制药重点实验室、酿酒与食品工程学院）的李荣源、卢红梅*和秦兴等人将通过高通量测序方法分析检测各阶段样品及药曲中细菌和真菌的种类和含量，结合微生物群落结构变化研究赤水晒醋发酵过程中物质含量变化的深层原因，对进一步了解赤水晒醋工艺和认识赤水晒醋具有重要意义。

1α多样性分析

根据97%相似性水平下的OTU信息，采用α多样性指标的ACE指数、Shannon指数及Simpson指数对样品微生物物种丰富度和多样性进行评估，结果显示，所有样品的OTU覆盖率为99.93%～99.99%，表明样品中的微生物种类几乎都被检测到。稀释曲线主要利用各样本测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，从而反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当稀释曲线趋向于平缓时表明测序数据量较为合理。基于97%相似度的OTU水平制作的细菌和真菌的稀释曲线如图1所示，曲线平缓，说明测序深度较好，测序数据量合理。

2 微生物的组成分析

由图2、3 可得，在目水平上，各个阶段的微生物结构差异明显，乙醇和醋酸发酵阶段的微生物结构有一定的延续性。药曲阶段，链霉菌亚目（Streptomycetales）、芽孢杆菌目（Bacillales）和乳酸杆菌目（Lactobacillales）是细菌优势菌目，占细菌总量的80%～98%，散囊菌目（Eurotiales）（96.7%～99.3%）是真菌优势菌目，且能看出各个样品间的差异较大，说明每个晒坛内部都具有独特的微生物结构。乙醇发酵阶段，乳酸杆菌目（86.7%～97.3%）是细菌优势菌目，有少量红螺菌目（Rhodospirillales）、梭菌目（Clostridiales）和芽孢杆菌目，散囊菌目（89.3%～95.3%）是真菌优势菌目，还有少量的丝孢酵母目（Trichosporonales）、酵母目（Saccharomycetales）（0.4%～8.7%）。醋酸发酵阶段，乳酸杆菌目（60.4%～81.6%）和红螺菌目（16.3%～32.4%）是细菌优势菌目，有少量芽孢杆菌目（1.5%～6.5%），散囊菌目（65.5%～84.5%）是真菌优势菌目，酵母目（5.6%～8.7%）的比例则在醋酸发酵阶段上升。醋醅曝晒阶段，红螺菌目（6.8%～34.3%）、芽孢杆菌目（5.5%～67.6%）、棒杆菌目（Corynebacteriales）（4.6%～17.8%）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）（2.0%～12.9%）、假单胞菌目（Pseudomonadales）（0.5%～9.1%）和乳酸杆菌目（0.8%～12.1%）等细菌均有发现，散囊菌目（2.7%～3 4.4%）、煤炱目（Capnodiales）（4.0%～28.3%）、格孢腔菌目（Pleosporales）（1.0%～33.9%）和酵母目（1.0%～6.2%）等真菌也被发现。

结果显示，18 种细菌和16 种真菌在每个阶段都有发现，且在乙醇发酵、醋酸发酵和曝晒阶段共有的真菌、细菌相对较多，在曝晒阶段独有的细菌种类数达到205 种，真菌种类数达到69 种，各个阶段的共有真菌、细菌种类数也体现出了菌群的延续性。

由图4、5 可知，细菌的芽孢杆菌属（Bacillus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）和真菌的曲霉属（Aspergillus）、嗜热真菌属（Thermomyces）都有较大相对丰度，这些菌属在药曲的生长代谢中会产生各种发酵所需的酶和氨基酸。这些菌种在发酵过程对分解淀粉、蛋白质等物质有重要作用。

药曲阶段，部分样品中链霉菌属（Streptomyces）有较大的相对丰度，能分泌抗生素类物质抑制其他菌种的生长，代谢生产抗肿瘤物质，还有糖单孢菌属（Saccharomonospora）、糖多孢菌属（Saccharopolypora）、丝孢酵母菌属（Trichosporon）等能分泌多种物质。

乙醇发酵阶段，曲霉属、嗜热真菌属和丝孢酵母菌属是真菌优势属，乳杆菌属是乙醇发酵中唯一优势细菌菌属，此外，醋酸单胞菌属（Acetobacter）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）在乙醇发酵醪液中都被检出。乙醇含量呈先增后降，酸度呈持续上升的趋势。乳杆菌属是乙醇发酵中唯一优势细菌菌属，也使得晒醋制备中不挥发酸比例较高，保证赤水晒醋独特的风味品质。

醋酸发酵阶段，醋酸单胞菌属的相对丰度明显增加，达到16.1%～31.6%，葡糖醋杆菌属也有增加，说明醋酸代谢较旺盛，由于乙醇发酵阶段乳杆菌属的大量存在，所以乳酸菌在醋酸发酵阶段仍占细菌的主体。醋醅曝晒过程中，微生物的种类大大增加，如红球菌属（Rhodococcus）、枝孢属（Cladosporium）、梗孢酵母属（Sterigmatomyces）、枝顶孢属（Acremonium）等，这些微生物促进了曝晒醋醅中各种物质的积累，提升赤水晒醋的品质。

由图6a可得，在细菌属水平，乙醇和醋酸发酵的聚类分析结果最为接近，表示这6 个样品所含细菌种类及其丰度相似，主要是由于2 个阶段的发酵环境具有延续性且相似。与之较接近的是醋醅曝晒阶段，分析是因为细菌主要来源于醋酸发酵醋醅，在曝晒中因环境的改变而形成独特的细菌结构，但仍有一定的连续性。药曲中形成了独特的细菌结构，这是不同的发酵环境所致。SCP-1与YQ-2被分为同一类，具体分析可以看出，SCP-1的细菌种类明显高于YQ-2，其原因是二者的链霉菌属、芽孢杆菌属和高温放线菌属的丰度较为接近。由图6b可得，样品真菌属与细菌属水平的聚类分类结果相似。乙醇和醋酸发酵被分在一个大类，药曲则因其优势菌属嗜热真菌属和曲霉属的丰度等级与之相似，也被分为一个大类，同样的也有SCP-2。嗜热真菌属丰度等级较高的JJFJ-1、JJFJ-2、 JJFJ-3和YQ-2、YQ-3分为一个小类，曲霉属丰度等级较高的CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3和YQ-1被分为另一个小类。曝晒醋醅的真菌种类明显比其他样品丰富，因此，曝晒醋醅被独立分为一类。

3β多样性分析

本研究使用weighted UniFrac距离算法分析赤水晒醋发酵各阶段的微生物多样性。由图7a可得，考虑到样本间的细菌种类和丰度因素，乙醇和醋酸发酵阶段各自为一个小类，然后聚为一个大类，表现出这2 个阶段的延续性和与其他阶段的不同。SCP-2、SCP-3和YQ-1、YQ-3同样各自为一个小类，然后聚成一个大类。但SCP-1和YQ-2被分为了一类，这一分类结果同样是由于二者的链霉菌属、芽孢杆菌属和高温放线菌属的丰度较为接近。但由β多样性可以看出，曝晒醋醅和药曲细菌多样性存在相似，与乙醇和醋酸发酵样品有明显差异，推测是由于两者相似的固态、高温和低含氧量的发酵环境。图7b中将乙醇发酵和药曲样品分为一类，然后与醋酸发酵和SCP-2分为一个大类，SCP-1和SCP-3则分为一类，说明药曲和乙醇发酵的真菌多样性相似，而SCP-2与SCP-1、SCP-3的相似性较低。

PCoA是一种非约束性的数据降维分析方法，使用PCoA图可展示各样品间微生物群落结构的差异。从图8a可得，PCoA1的贡献率为64.59%，可知乙醇和醋酸发酵的细菌微生物结构相似，药曲和曝晒醋醅的细菌微生物结构相似，但样品之间差异性较大，尤其是YQ-2和SCP-1与其他同一阶段样品距离较远。图8b则显示，药曲、乙醇和醋酸发酵样品的真菌微生物结构相似，与曝晒醋醅样品有明显区别，并且曝晒醋醅样品之间也有较大差异。这符合聚类分析结果，但PCoA可清晰反映曝晒醋醅样品之间微生物结构的较大差异，分析是因为醋醅分装在晒场的曝晒坛内，无论是装坛以前的微生物结构，还是曝晒环境都存在区别，导致曝晒醋醅样品之间的微生物结构有明显差异。

结 论

本研究采用高通量测序检测赤水晒醋各生产阶段微生物群落结构，结合丰度聚类热图和β多样性分析表明。对于细菌，乙醇发酵和醋酸发酵相似度最高。对于真菌，药曲制备、乙醇发酵和醋酸发酵的微生物结构相似度较高，醋醅曝晒阶段的微生物结构则有明显差异。发现从药曲、乙醇发酵、醋酸发酵至醋醅曝晒都有微生物的传承，但每个阶段存在环境和条件的差异，使微生物结构不断变化，尤其是在醋醅曝晒阶段各个样品之间的差异更为明显。

通过微生物结构分析，在乙醇发酵和醋酸发酵阶段都是乳杆菌属、醋杆菌属和曲霉属、嗜热真菌属、丝孢酵母属占绝对优势菌属，起到了主导作用，这两个阶段是赤水晒醋中主要物质积累的过程，生产大量的有机酸、氨基酸等物质。在醋酸发酵和醋醅曝晒阶段，酵母菌的活性并没有受到抑制，共检出了梗孢酵母属、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）、红酵母属（Rhodotorula）和丝孢酵母菌属等非酿酒酵母，并且在部分样品中有较高的相对丰度，它们能够产生包括萜类化合物、酯类、高级醇、丙三醇、乙醛、乙酸和琥珀酸的风味化合物，增加了赤水晒醋中风味成分的种类和含量。而醋醅曝晒阶段微生物结构则不同于其他阶段，无论是细菌还是真菌都没有绝对优势菌种存在，同时也是微生物种类最多的阶段，有194 种真菌和400 种细菌被检测到。因此，在这一重要阶段会代谢生产大量营养物质，从而形成赤水晒醋独具特色的风味品质。

本文《高通量测序分析赤水晒醋各生产阶段微生物群落结构变化》来源于《食品科学》2020年41卷24期78-86页，作者：李荣源，卢红梅，秦兴，陈莉，汪沙，吴震。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191022-228。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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