专家点评 | Science Advances：全新解析三羟基丁酰化修饰调控酶和蛋白底物

报道|景杰学术

点评 |梁静-北大医学部

众所周知，代谢物除了作为能源和代谢中间产物外，还可以通过共价或非共价的方式结合蛋白质来发挥信号传导功能。例如，乙酰-CoA（acetyl-CoA）和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）可以作为供体被乙酰基转移酶和甲基转移酶催化转变为组蛋白赖氨酸乙酰化和甲基化修饰，这种由代谢物介导的表观遗传变化是细胞应答外部环境改变的重要调控机制之一。

除了组蛋白乙酰化和甲基化，近些年来芝加哥大学赵英明教授课题组结合质谱和生物化学等技术，在国际上率先报道了发生在组蛋白赖氨酸上的10种新型酰化修饰，包括丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、丙二酰化、琥珀酰化、戊二酰化、三羟基丁酰化、二羟基异丁酰化[1]、苯甲酰化[2]和乳酸化[3]，上述原创性工作极大地丰富了对组蛋白密码、表观遗传学和翻译后修饰领域研究的认识。

在众多新型蛋白质酰化修饰中，三羟基丁酰化（Kbhb）由赵英明教授团队2016年在Molecular Cell发文首次报道，揭示了脂肪酸氧化代谢产物，酮体重要组分三羟基丁酸能介导组蛋白Kbhb修饰发生，该修饰富集在活化基因的启动子区域，介导饥饿应答的代谢调控[4]。尽管过去几年针对该修饰的调控机制和功能已经有了一些研究进展，但是该修饰的关键调控酶（例如“Writer”、“Reader”、“Eraser”）和底物蛋白目前尚不清楚。

2021年2月24日，来自芝加哥大学赵英明教授和中科院上海药物研究所黄河教授研究团队在Science Advances（IF=13.117）上发表了题为“The regulatory enzymes and protein substrates for the lysine β-hydroxybutyrylation pathway”的研究论文，揭示了无论是在体内还是体外，酰基转移酶p300可以催化Kbhb发生并促进下游转录，而HDAC1和HDAC2则通过酶活介导去除Kbhb。此外，通过HEK293细胞的Kbhb修饰组学鉴定到了1397个蛋白上的3248个Kbhb修饰位点。该研究揭示了Kbhb修饰关键调控酶和蛋白底物，为研究Kbhb在多种生物学进程中的作用奠定了基础。

1. p300在体外催化组蛋白Kbhb并激活转录

之前的研究表明p300可以作为酰基转移酶调控乙酰化、丙酰化和巴豆酰化，而且p300的ac-CoA结合口袋可优先结合不带电的短链酰基辅酶A，因此研究者猜测p300极有可能催化Kbhb。接下来研究者利用依赖组蛋白酰化修饰反应的体外重组转录体系证明p300确实发挥体外核小体上组蛋白Kbhb的转移酶功能并直接激活体外转录。

图1 p300在体外催化组蛋白Kbhb并激活转录

2. p300在细胞内具有组蛋白Kbhb转移酶活性

为了进一步验证ex vivo 水平上p300是否具有Kbhb转移酶活性，研究者对培养的细胞中组蛋白Kbhb水平进行了检测。首先，通过敲低p300或CBP发现组蛋白Kac和Kbhb水平显著降低。同时，在p300敲除的HCT116细胞中，多个组蛋白上Kbhb水平降低，并且一些组蛋白Kbhb对p300敲除的敏感性高于相应位点的Kac。进一步在HCT116细胞中通过A485选择性抑制p300催化活性的结果显示，H3K9、H3K18和H4K8上的Kac和Kbhb水平在A485处理后呈现剂量依赖性地降低。以上结果证明在细胞内p300同样具有组蛋白Kbhb转移酶活性。

图2 p300在细胞中具有组蛋白Kbhb转移酶活性

3. HDAC1和HDAC2是细胞内Kbhb去酰化修饰调控酶

鉴于一些组蛋白去乙酰化酶（HDAC）具有不依赖乙酰化的脱酰基活性，接下来研究者针对HDACs是否发挥Kbhb去修饰调控展开了研究。首先通过体外实验发现， HDAC1-11和SIRT1-7中，只有HDAC1-3和SIRT1-2在体外具有移除Kbhb的活性。

接下来研究者对HDACs是否具有ex vivo 水平上去调控Kbhb活性进行研究。首先在HEK293细胞里用丁酸钠（NaBu），曲古抑菌素A（TSA），FK228和烟酰胺（NAM）这四种HDACs抑制剂进行处理（其中NAM是III类HDACs抑制剂，其他三种是I类和II类HDACs抑制剂），结果显示I类和II类HDACs抑制剂能刺激Kac和Kbhb水平变化，并且TSA能以剂量依赖性方式调控Kac和Kbhb。进一步实验结果显示，敲低HDAC1和HDAC2可增加HEK293和HeLa细胞中Kbhb的水平；选择性HDAC1/ 2/3抑制剂MS275处理细胞后，以剂量依赖性方式增加多个Kbhb位点信号。上述结果表明HDAC1和HDAC2在体外和细胞内都能发挥Kbhb去酰化修饰调控酶功能。

4. 蛋白质组学鉴定HEK293细胞中的Kbhb底物

为了进一步鉴定Kbhb修饰底物，研究者通过基于Kbhb泛抗体富集的蛋白修饰组学展开研究，共鉴定到1397个蛋白上的3248个Kbhb修饰位点。功能研究发现，除了组蛋白修饰，Kbhb通过影响整个蛋白质组中的多种底物来发挥信号调控作用。亚细胞定位分析显示，大部分Kbhb修饰（占比78.2%）存在于核蛋白上，仅有12.8％的Kbhb蛋白位于线粒体中，提示Kbhb与Ksucc和Kma在功能上有所差异。KEGG通路富集分析发现修饰蛋白主要参与到剪接体、核糖体、RNA转运功能和DNA修复相关途径中。蛋白质复合物富集分析蛋白-蛋白相互作用网络发现，BAF、E3泛素连接酶和MeCP1复合物富集最显著。这些结果表明，Kbhb功能广泛，参与到多种细胞过程中，包括染色质重塑、转录调控和DNA修复等。

图4 蛋白质组学鉴定HEK293细胞中的Kbhb底物

本篇研究利用生物化学和蛋白质组学方法对Kbhb调控进行了研究。除了证明Kbhb在体外能激活转录，研究者还鉴定了Kbhb“Writer”（即p300）和“Eraser”（即HDAC1和HDAC2）。除此之外，通过蛋白质组学分析，鉴定了HEK293细胞中1397个蛋白质上的3248个Kbhb位点并揭示了Kbhb潜在的广泛功能。综上，本篇研究不仅鉴定了Kbhb的调控酶，还扩展了该修饰调控的蛋白质底物以及潜在的信号通路，为进一步探索Kbhb在各种生理病理条件下的功能提供了基础和新视角。

专家点评

梁静-北京大学基础医学院研究员：

蛋白质的翻译后修饰是其功能调控的重要机制。随着高分辨率质谱技术在近年来的快速发展，多种与乙酰化结构相似的新型蛋白质酰化修饰被陆续鉴定，包括甲酰化、丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙二酰化、3-羟基丁酰化、2-羟基异丁酰化、戊二酰化、乳酸化等。这些研究极大地扩展了蛋白质翻译后修饰的种类，也为进一步鉴定其功能提出了更多挑战。在众多酰化修饰中，赖氨酸3-羟基丁酰化 （lysine β-hydroxybutyrylation, Kbhb） 修饰的供体分子β-羟基丁酰辅酶A的前体物质为β-羟基丁酸，是酮体的主要成份之一。酮体生成是以脂肪酸β-氧化生成的乙酰CoA为原料，在肝线粒体有酮体合成酶系完成。经典的生化理论认为，酮体的主要功能是机体在饥饿时的替代能量来源，经由肝细胞释放入血后，为脑、心脏等其他组织所利用。病理状态下如糖尿病引起的糖类物质利用受阻，也会诱导酮体的产生。持续的高酮血症会导致包括神经系统及消化道在内的多脏器损伤。在分子水平上，酮体分子的生理及病理作用还有待探究。

组蛋白Kbhb修饰于2016年由芝加哥大学赵英明教授课题组 [6] 首先报道。有趣的是，研究者发现饥饿小鼠的肝细胞中，组蛋白Kbhb水平明显升高，并且能够激活转录，从而促进饥饿应答的代谢调控基因表达。这项研究将代谢物水平改变与细胞的表观遗传调控网络有机地联系起来，提示组蛋白Kbhb所介导的染色质状态及基因表达谱改变是细胞应答酮体升高的另一种重要机制。之后陆续有课题组发现肿瘤抑制因子p53能够发生Kbhb修饰，其加成反应被CBP/p300所催化 [7] 。SIRT3则具有类别选择性的去组蛋白Kbhb活性，偏好性识别和催化S-手性 Kbhb 底物 [8] 。由于细胞内存在的Kbhb底物以R-手性为主，关于调控组蛋白Kbhb的“writer”、“eraser”、“reader”分子的鉴定，及组学层面寻找Kbhb蛋白质底物的工作仍然缺乏，限制了对Kbhb修饰更深层次生物学功能的有效挖掘。

在新一期的Science Advances 文章中，赵英明教授团队联合中科院上海药物研究所黄河教授团队，继续了他们对蛋白质Kbhb修饰的系统性研究。研究者鉴定了p300为组蛋白Kbhb转移酶，而HDAC1/2则在细胞内外均具有去Kbhb酶活性。另一方面，他们还鉴定了更多的非组蛋白Kbhb底物，证明其参与DNA解旋、RNA剪接、染色质重塑、及转录调控等多个生物学过程。这项工作的发表，为进一步研究不同生理病理状态下的Kbhb调控机理扫清了初步障碍，所带给我们的启发也是多方面的。例如，在已知的经典乙酰化酶中，目前已经发现p300所具有的酰基转移酶活性最为多样。既然酰化修饰存在功能特异性，决定p300酶活特异性和选择性的主要因素究竟是什么？细胞内相应酰基辅酶A浓度的动态变化显然是其中一个原因。然而，由于大多数情况下乙酰辅酶A的浓度都高于其他酰基辅酶A，这方面的调控机制还需要更多的研究来澄清。再者，酮体生成主要是在肝细胞线粒体中进行，周围组织细胞内的酮体则从血循环中摄入，而目前所发现的Kbhb底物更多集中于细胞核内的蛋白。那么，决定不同酰化修饰的细胞器偏好性的因素有哪些？此外，已知高酮血症引发神经系统毒性，而临床上β-羟基丁酸可以作为抗癫痫药物使用。在这些过程中，神经细胞内的组蛋白及非组蛋白Kbhb修饰是否发挥功能？其调控机制是什么？总的来说，这项系统性的工作丰富了我们对Kbhb修饰的认知，也为生命科学领域提出了更多未来值得进一步探索的方向。

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参考文献：

1. Sabari B R, et al. 2016. Metabolic regulation of gene expression through histone acylations.Nat Rev Mol Cell Bio.

2. Huang H, et al. 2018. Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2.Nat Commun.

3. Di Zhang, et al. 2019. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.Nature.

4. Zhongyu Xie, et al. 2016. Metabolic Regulation of Gene Expression by Histone Lysine β-Hydroxybutyrylation.Mol Cell.

5. He Huang, et al. 2021. The regulatory enzymes and protein substrates for the lysine β-hydroxybutyrylation pathway.Sci Adv.

6. Z. Xie et al. 2016. Metabolic Regulation of Gene Expression by Histone Lysine beta-Hydroxybutyrylation.Mol Cell.

7. K. Liu et al. 2019. p53 beta-hydroxybutyrylation attenuates p53 activity.Cell Death Dis.

8. X. Zhang et al. 2019. Molecular basis for hierarchical histone de-beta-hydroxybutyrylation by SIRT3.Cell Discov.

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