近日，中国农业大学资源与环境学院生态与功能农业课题组郭岩彬副教授在生态环境科学和工程领域Top期刊《Journal of Hazardous Materials》上发表题为“Highly stable selenium nanoparticles: Assembly and stabilization via flagellin FliC and porin OmpF in Rahnella aquatilis HX2”的文章。
硒是人和动物必需的微量矿质元素，但其有益到有害的浓度范围较窄，成为制约硒营养强化等应用的关键问题。纳米粒径的单质硒（纳米硒）因具有活性强、毒性低等特点使其成为解决硒应用浓度范围窄的最佳硒形态，同时纳米硒在生物体内表现出抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多重生物活性而备受国内外关注。纳米硒可以通过化学还原方法获得（化学纳米硒），也可以通过微生物（细菌等）生物合成途径获得（生物纳米硒）。与化学纳米硒相比，细菌合成的生物纳米硒具有稳定性高、活性强、生物转化效率高、环境风险小等优势，使其成为国内外研究的热点。但国内外关于生物纳米硒在细菌体内如何组装以及其结构稳定机制还缺乏系统性研究。该研究揭示了细菌生物合成纳米硒在体内的组装控制及维持其结构稳定性的机制。
生物纳米硒组装与结构稳定示意图
课题组利用生物纳米硒高效合成菌株Rahnella aquatilis HX2发酵合成生物纳米硒，并将其进行了分离和纯化，获得的生物纳米硒与化学纳米硒相比，在酸、碱、阳离子、氧化剂和高低温等条件下具有显著性的稳定性。为解析细菌合成的生物纳米硒高稳定性机制，从纯化的生物纳米硒上剥离获得两种蛋白，分别为鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF。在R. aquatilis HX2菌体内通过基因缺失突变，获得fliC 和ompF单基因突变体，或fliC 和ompF双基因突变体，无论单基因突变还是共同突变，都不影响生物纳米硒在细菌中的合成量，但影响生物纳米硒在细菌中的组装，在突变体中生物纳米硒球形组装能力丧失，生物纳米硒由球形变成了不规则形。在突变体中遗传互补fliC 和ompF基因后，生物纳米硒的组装得到恢复，恢复成球形纳米硒，从而揭示了生物纳米硒在细菌体内维持球形结构的稳定性机理。
FliC 和OmpF在细菌体内控制生物纳米硒组装和形态
为验证鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF是否具有体外组装功能，将HX2菌株的鞭毛蛋白FliC-HX2 和孔蛋白OmpF-HX2和大肠杆菌K12菌株中的鞭毛蛋白FliC-K12 和孔蛋白OmpF-K12分别进行了外源表达和纯化。利用外源表达蛋白在体外进行纳米硒组装，结果表明FliC-HX2、OmpF-HX2、FliC-K12 和OmpF-K12都可以在体外实现纳米硒的组装，其中来源于HX2菌株的FliC-HX2和OmpF-HX2蛋白组装的纳米硒比大肠杆菌的FliC-K12 和OmpF-K12组装的纳米硒粒径小。从体外组装的纳米硒上剥离蛋白，并利用抗体对剥离的蛋白进行Western blot检测，验证了纳米硒体外组装由这四个蛋白分别控制。研究结果说明鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在无论是细菌体内还是在体外都可以控制纳米硒的组装。
FliC 和OmpF在体外控制纳米硒组装
为进一步分析验证鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF在生物纳米硒结构稳定中的作用，利用外源表达的FliC-HX2和OmpF-HX2对化学纳米硒进行表面修饰，在强酸、强碱、高离子浓度条件下分析修饰后的化学纳米硒的稳定性，并以纳米材料常用的结构稳定剂SDS、PEG、BSA、PVP，以及大肠杆菌的FliC-K12 和OmpF-K12作为对照，SDS和PEG在强酸碱等测试条件下无法稳定化学纳米硒的结构，BSA、PVP、FliC-K12 和OmpF-K12在不同程度上均可以提高化学纳米硒的稳定性，水生拉恩氏菌FilC-HX2和OmpF-HX2的稳定效能是PVP、BSA以及大肠杆菌FilC和OmpF的10-100倍。研究结果表明，水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF对维持生物纳米硒的结构稳定具有极其重要的作用，并能够在体外显著提高化学纳米硒的结构稳定性，该研究同时也发现水生拉恩氏菌HX2的鞭毛蛋白FliC 和孔蛋白OmpF对维持纳米硒的结构稳定能力具有特异性。该研究为纳米硒在农业（种植、养殖等）以及生物医药等领域的应用提供了理论与技术支持。
FliC 和OmpF表面修饰化学纳米硒提高其稳定性
据悉，近年来课题组共筛选获得高效合成生物纳米硒的细菌菌株近1000株，并完成了生物纳米硒工厂化发酵工艺和分离纯化工艺，建立了生物纳米硒规模化生产技术。相关技术成果在黑龙江、江西、湖南、重庆、河北、山西等十多个省市的小麦、水稻、大豆、小米等近20种作物示范推广10多万亩，取得了显著经济和社会效益。本研究内容已申请国家发明专利“提高纳米材料稳定性的方法（2021101035703和2021101052624）”，课题组已获授权生物纳米硒国家发明专利6项，化学纳米硒国家发明专利1项，其中“利用地衣芽孢杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用（ZL201610946282.3）”已经完成成果转化，并被北京市知识产权局评选为“2018年度专利商用化优秀项目”。
博士生李奎为论文第一作者，郭岩彬副教授为论文的通讯作者。论文得到国家自然科学基金(项目编号：31470531)和国家公益性行业(农业)科研专项“优质高效富硒农产品关键技术研究与示范”（项目编号：201303106）项目资助。
来源：中国农业大学
https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.125545
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