手把手教你如何看“生化反应曲线”

生化反应曲线是整个生化反应过程的记录，通过查看反应曲线我们可以知道这个结果是否可靠，也可以发现一些仪器故障（试剂针加样不足、冲洗机构冲洗问题），也能提醒我们光源灯能量不足（俗称，换灯泡），也能查看速率法项目是不是底物耗尽。

那么，到底怎么去看生化反应曲线呢？

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生化反应曲线基础理论

分光光度仪原理，运用的是朗伯-比尔定律：A=KbcA为吸光度，K为摩尔吸光系数，它与吸光物质的性质及入射光的波长λ有关，c为吸光物质的浓度,单位为mol/L，b为吸收层厚度，单位为cm。Lambert-Beer 定律适合于任何均匀非散射的介质，当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度。光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。常用波长: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm ，多数检测项目都使用双波长检测方法。（可去除干扰物对检测结果的影响）

全自动生化分析仪常用的方法：终点法和速率法。

1、终点法

（一点终点法、两点终点法）被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。

一点终点法：在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。结果计算公式：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K K为校准系数 两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。

2、连续监测法（速率法）

是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期（各两点间吸光度差值相等）的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变化值（ΔA/min）计算结果。可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。

连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物。 酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值。 代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。

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反应曲线是什么？

炒菜，应该大家都会吧？

其实，生化项目的检测过程跟炒菜比较相似，炒菜的基本流程是：放油→放菜→放盐，如果每隔18秒，对菜的味道进行打分并记录，再把各个点连接绘成一条曲线的话，炒菜的反应曲线大致是这样的，见下图：

如果只是把油→菜→盐，按顺序放进锅里，这一锅菜应该是没法吃的，对吧？至少得在放油、菜、盐的时候用锅铲搅拌混匀一下，对吧？于是炒菜的反应曲线变成了这样，见下图：

那么，对应的生化项目检测(以奥林巴斯AU系列为例)是这样的：首先，仪器会向反应杯加入试剂1(R1)，紧接着加入样本(S)， 搅拌混匀，3分钟后加入试剂2(R2)，搅拌混匀。在这个过程中，仪器会每隔18秒测试一次吸光度并记录，总共28(0-27)个点，然后连接成线，就是我们所看到的反应曲线，见下图：

所以，反应曲线是项目检测整个过程的记录，相当于是一个静态的录像。

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反应曲线怎么看？

在整个检测过程中，试剂1(R1)、样本(S)、试剂2(R2)加入以及搅拌的时间点都是固定的。我们知道了反应曲线是怎么来的之后，需要知道什么样的曲线算正常。

一般正常的反应曲线：a.比较平滑，无明显的跳点；b.加入R2前后吸光度会发生明显的变化(低浓度样本除外)；c.终点法的反应曲线，会有一段曲线的吸光度基本无变化；d.速率法的反应曲线，基本成一条直线(两点速率法除外)。

生化的反应曲线可以分为终点法和速率法两大类，以下列举了一些正常的反应曲线供参考：

1)终点法的反应曲线：

反应到达终点后反应混合物的吸光度不再变化(R1主要用于消除干扰，R2加入之后，反应启动)，就像你炒好的菜在一段时间内味道是不变的。如下图：

2)速率法的反应曲线：

随着反应的进行，吸光度越来越大，但速率保持不变，R2之后基本成一条直线，无明显跳点(两点速率法除外)，如下图：

注：上图在加入R2之前为虚线，是因为R1+S的体积小于仪器要求的最低的反应总体积。

我们在看反应曲线的时候，眼里是一条曲线，脑袋里面浮现的应该是整个的检测过程，去还原仪器的动作，分析从什么时候吸光度突然变得异常。你可以想象成这盘菜是怎么炒出来的。

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反应曲线有什么用，什么时候用得着？

1)结果出现负值(终点法项目)：

a.反应曲线有可能是一条直线，样本或R2有可能没有加入；

b. R2加入之前的吸光度比加入后还高，试剂1和试剂2位置放反或者严重脂血标本。

2)结果明显偏低(速率法项目)：

反应曲线可能变成了类似于终点法的曲线，也就是我们通常说的底物耗尽，需要稀释重测。

3)试剂过期或污染、搅拌棒破损、携带污染以及冲洗站滴水也会在反应曲线上有所体现。

4)总之，在结果比较可疑的情况下，可以调出反应曲线看看是否正常，有助于找出问题所在。

4.注意事项：

1)不同厂家或型号的仪器，加入样本和试剂的顺序可能不同，比如，日立是S+R1+R2。

2)部分仪器横坐标是直接用时间表示，比如贝克曼LX/Dxc系列用的是秒，另外LX/Dxc系列的加样顺序有可能是R1+S+R2或者R1+R2+S。

3）部分仪器没有把各个点连接起来，所以看到的是由点组成的曲线。

4)看反应曲线时，注意纵坐标的刻度，就像远看是美女，近看就不一定了。

5)反应曲线界面还可以看到很多的信息，比如：光电校正、试剂空白、定标的时间以及每一点的吸光度，这些都会有助于判断结果异常的原因。所以，你应该已经意识到，当有人问为什么某项目的结果偏低、不正常时，仅凭一个结果是很难判断的。

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常见正常反应曲线简易图

终点法

速率法

固定时间法

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常见异常反应曲线

1、比色杯异常：

2、搅拌棒问题

3、冲洗站问题

4 底物耗尽

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如何避免底物耗尽带来的误差？

一方面，在审核报告时，要综合考虑整张报告单各个项目的结果，对有疑问或者矛盾的项目结果，要查看反应曲线，并及时与临床医生沟通，结合病人的情况评估检测报告是否存在偏差。

另一方面，可以借助生化仪上面自带的参数设置，设置好底物耗尽的相关参数，让仪器自动报警。

由于不同厂家的仪器所给定的参数不同，底物耗尽的参数大概分两种：

1. 线性度：一般厂家设定的线性度为 15%，其含义就是所有检测点的 O D 值与理想拟合曲线的线性相关度要在 15 %之内 , 超出这个范围就是超限 , 仪器对此结果就会报警。以图2为例，反应阶段读取的曲线是 b-c-d，而最后计算的曲线是 b-d，明显可以看出c点远离了 b-d 直线，c 点附近读取的吸光度都偏离大于 15%，仪器会报警。个人意见，15%的线性度有些大，最好设置在 10%以内，以保证结果的准确性。

2. 吸光度限值或者反应界限：也就是单位时间内吸光度的变化（上升或下降）不能超过多少，或者初始反应的曲线斜率不能超过多少，以保证在读取反应阶段的吸光度结束前，底物都还是充足的。但由于这个参数的设置跟底物的量，反应阶段开始和结束的时间设定等都有关系，因此这个参数没有定值，厂家一般不会给这个参数值（除非是封闭系统），因此如果要设置这个参数，需要检验人员自己用一个最大线性左右的样品，通过这个样品的吸光度变化来计算这个参数。

来源：临床检验医学

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编辑：笪文武 审校：陈雪礼