陈鸣教授：纳米技术及生物传感器用于临床检验诊断的研究

今天，检验君为大家分享的是陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授课题组关于纳米技术及生物传感器在临床检验诊断中的研究前沿。

CRISPR在精确药物递送和生物传感器等方面的应用

CRISPR和CRISPR相关的（Cas）适应性免疫系统包含RNA引导的核酸内切酶，能够进行精确的核酸水解。由于其特异性和可编程性，CRISPR-Cas酶已被用作有效的基因编辑以及临床检验诊断工具。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授与美国康奈尔大学罗丹教授在国际顶级医学期刊《NEJM》在线发表题为“ACRISPR Path to Cutting-EdgeMaterials”的专家述评，介绍CRISPR在精确药物递送和生物传感器等方面的应用。

众所周知，人类已经开发和合成了许多用于生物医疗的材料，如早期的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）。和PLGA类似，DNA也属于聚合物，因此，它也能够成为药物递送载体。事实上，科学家们已经成功地制成了以DNA为材料的水凝胶，并将其用于递送药物以及无细胞生产蛋白质。

据文章介绍，CRISPR系统中应用最广泛的是CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cas12a系统。Cas9是一种核酸内切酶，能够在特异性识别位点切割双链DNA，切割位点由引导RNA的序列决定。与Cas9相同，活化的Cas12a可以靶向切割双链DNA；但不同于Cas9，Cas12a激活后还会以每秒1200次的切割速度非特异地切割单链DNA，并造成一些附带损伤。科学家们正是利用CRISPR-Cas12a系统的上述特点，创制了多种水凝胶新材料，并用于药物递送和生物传感。

述评指出，该系统的最大优点是易于定制，能够将诸如聚丙烯酰胺和聚乙二醇这种传统材料制成可编程的凝胶。目前科学家们已经发现了几十种天然Cas蛋白，通过突变等蛋白质工程手段，可以轻而易举地对这些蛋白进行改造。同时还有成百上千种DNA酶，能够用于DNA的编辑和修饰。由此可见，未来科学家将能够设计并制造出大量性能各异的新型材料，以满足多样的临床需求。

文章链接：

https://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMcibr1911506

一种超便携多功能POCT DNA检测平台

床旁检测（POCT）具有检测快速、操作简便、仪器便携等优点，十分适合于在资源有限的环境中使用，其中DNA分析被广泛应用于临床诊断，但是目前DNA分析的POCT技术仍然面临着较大的技术挑战。

日前，陆军军医大学西南医院陈鸣教授团队联合美国康奈尔大学罗丹教授及中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所甘明哲教授团队采用3D打印技术，结合微流控技术和智能手机终端的优点，构建了一种DNA的POCT分析平台（POCKET平台），可以通过采样-反馈的方式分析不同领域中的多种类型的DNA。该研究发表在《Science Advances》,并作为当期Highlight工作推荐。

该POCKET平台由集成芯片（i-chip）和可折叠盒（f-box）组成。i-chip集成了样品制备、信号放大和结果读取的检验过程，实现了全流程样品进、结果出的快速检验。f-box利用智能手机作为加热器、信号检测器和结果读数器，实现了仅仅利用一台普通的智能手机，无需专业的配套仪器设备，即可实现DNA的快速检测。

为了实现肉眼判读和智能手机结果分析，特开发了一种全新的信号放大系统——iRPAS 信号三重放大方法。第一重放大，提取的DNA通过等温扩增20min，并修饰上生物素；第二重放大，生物素DNA与芯片上的探针结合后加入链霉亲和素化的金纳米材料，并与其结合上；第三重放大，注入银离子溶液，通过银离子催化级联反应，使得越来越多的银离子沉积在纳米表面，可实现颜色信号的进一步加强。

为了评价其检测性能，研究人员总共收集了172份标本，包括63份外周静脉血标本、55份从临床血液标本中纯化的DNA标本、20份咽拭子标本和34份尿液标本，并将本平台分析结果与临床实验室使用的传统金标准方法进行了比较。发现该平台的检测灵敏<1000拷贝/mL、可识别单碱基突变、检测速度快（小于2小时）和检测结果稳定等优点。

研究人员表示，这种经济、超便携的即时检验平台有望成为临床诊断、食品安全、农业保护和环境监测的通用DNA即时检验平台。

文章链接：

https://advances.sciencemag.org/content/6/17/eaaz7445

三维DNA纳米镊子可检测和调控细胞内microRNA

MicroRNAs（miRNAs）是一种内源性小型非编码单链RNA，在细胞增殖、发育和成熟中扮演着非常重要的角色。尽管抑制miRNAs的异常表达可以减缓疾病的进展，但是目前还缺乏靶向和触发药物释放的方法。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授课题组构建了一个模块化的三维DNA纳米镊子（TD-tweezers）结构，可以对活细胞中的miRNAs进行成像、检测和调节，并初步验证了其临床应用潜力。该研究发表在《Science Advances》。

有研究表明，DNA四面体可通过小窝蛋白介导的途径被迅速内吞进入细胞，并且能够在细胞中维持结构超过48小时，基于此，研究人员设计了一个能够直接靶向和调节miRNAs的三维DNA纳米镊子TD-tweezers。

为了验证TD-tweezers的组装结构和miRNA响应功能，研究人员使用miRNA-34a作为目标miRNA，用琼脂糖凝胶电泳表征了TD-tweezers的组装过程，并使用Cy3及其猝灭基团BHQ-2来证实TD-tweezers的miRNA响应功能，证实了TD-tweezers检测和调控miRNA的可行性。

随后对TD-tweezers的检测性能进行了研究，并表明TD-tweezers具有较好的特异性，可有效降低假阳性率。此外，研究发现TD-tweezers对活细胞没有明显的细胞毒性或副作用，表明TD-tweezers具有良好的生物相容性。

由于其独特的DNA四面体结构，TD-tweezers具有较好的生物稳定性和细胞传递效率。除了miRNAs抑制剂，该结构还可以携带其他调节分子甚至药物，这将有助于miRNAs或其他特异性分子在细胞内的生物学定位及实时调控。

总之，该设计提供了一个多功能平台，可以实现对活细胞内靶标的有效检测和调控，并促进DNA智能机器的发展，也是实现对生物分子的全面检测和调控的一种新的尝试。

文章链接：

https://advances.sciencemag.org/content/6/22/eabb0695

基于微纳技术的下一代诊断方法

为了应对随着社会科技发展所遇到的各种新的挑战，对于现有检测诊断技术的开发和升级就显得尤为重要。而微纳技术作为一种可在微观尺度上对物质进行设计和调控的崭新方法，其设计对象涵盖了包括细胞、亚细胞器、蛋白质以及核酸等在内的生命组成元件。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授与美国康奈尔大学罗丹教授从微纳传感器芯片、DNA纳米机器以及DNA纳米材料三个方面，对可用于下一代诊断应用的微纳技术进行了总结。相关工作应邀在《Small Methods》杂志进行专家述评。

相较于传统检测诊断技术，基于微纳技术的诊断方法具有更加独特的优势：①由于微纳结构或微纳材料本身所具有的更大的比表面以及更高的反应活性，使得其更容易实现单分子水平的灵敏度；②相较于传统方法，基于微纳技术的检测诊断其操作更加简单快捷；③对于不同的检测对象，例如小分子、核酸、蛋白质或者细胞，基于微纳技术的诊断方法更具有普适性；④更具有发展为床旁检测技术的潜力。

因此，该文章对微纳技术进行相关总结，在微纳传感器芯片中，着重介绍了太赫兹技术以及声表面技术所展现出的无需标记、无需信号放大所展现出来的超高灵敏度；在DNA纳米机器中，DNA镊子、DNA机器人以及DNA步行机等则表现出在基于任意结构设计与可控运动的诊断方法中的强大应用潜力；而对于功能性DNA纳米结构，包括DNA核酸适配体、DNA酶以及复合DNA纳米材料等，则为敏感的生物识别和多功能的信号传导提供了可靠的候选材料。

作者表示，通过该篇综述，可以预见微纳米技术将在下一代诊断学中发挥重要作用。

文章链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/smtd.201900506

基于Y形DNA结构和非线性杂交链反应的电化学生物传感器

纳米材料已成为生物检测的通用工具，如金属基纳米材料、聚合物基纳米材料和碳基纳米材料等，DNA作为一种被忽视的生物材料，具有很高的可操作性和选择性，其中Y形DNA（Y-DNA）作为一种具有高选择性的稳定纳米结构，可为精确测量目标分子提供了有效方法。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授课题组将Y-DNA结构与非线性杂交链式反应（非线性HCR）相结合，开发了一种定量检测miRNA的免标记电化学方法生物传感器。该研究发表在《Biosensors and Bioelectronics》。

目前已经开发了许多信号放大策略，包括滚环扩增（RCA）、催化发夹组装（CHA）、链位移放大（SDA）和杂交链式反应（HCR）等。其中，HCR已经从传统的线性探针杂交发展到复杂的分支非线性探针杂交，可以获得更高的扩增率和分子量。基于此，研究人员开发了一种定量检测miRNA的无标记电化学生物传感器，由Y-DNA探针和非线性HCR系统两部分组成。

首先，Y1、Y2和Y3通过自组装形成Y-DNA探针。Y2和Y3之间设计了一个单一碱基缺陷，以提高下一个竞争组合的效率。此外，Y1、Y2末端在暴露后能够启动随后的非线性HCR。将Y-DNA探针固定在金电极表面后，加入待测靶标miRNA-25，miRNA-25可与Y3完全杂交。由于Y2和Y3之间存在未配对的结构域，miRNA-25能够取代载体序列，使Y3远离Y-DNA纳米结构。因此，之前受到Y3保护的触发端可暴露并触发非线性HCR。

该扩增系统由两个双链底物（S1，S2）和两个单链辅助物（H1，H2）组成。末端触发器与S1杂交，替换S1b的一部分。然后H1与新暴露的S1b的立足点结合。由于S1中间存在桥环，S1b从原来的双链底物中释放出来，形成新的副产物B1。S1a支架暴露了两个相同的序列，可以作为与S2的立足点相互作用的新触发器。H2支架与新暴露的S2b趾部相似地杂交，从先前的基质中去除S2b。到此，该反应已经形成了一个具有两个触发点的支链DNA纳米结构，这两个触发点与之前的相同，可以引发新一轮的反应。通过级联反应形成树枝状DNA纳米结构，最终实现信号的放大。

在最佳条件下，该感传感器线性范围为1fM至10pM，检出限低至0.3334fM。Y-DNA的特殊设计帮助生物传感器获得了区分单碱基突变的能力。而且，该生物传感器能够检测临床血清标本中的miRNA。

研究人员表示，该生物传感技术可拓展DNA纳米材料在生物检测中的应用，实现对各种疾病的早期有效检测。

文章链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566318309230

meta-LFICS实现稳定和定量的生物检测

侧流免疫层析技术（LFICS）是一种将免疫技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法，具有简单、快速、成本低等优点，得到了广泛的应用。但早期只能提供定性结果，信号强度低、灵敏度低等缺点，因此，改进LFICS技术十分有必要。

日前，重庆大学光电工程学院牟笑静教授团队联合陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授团队开发出一款集成了平面方形开口环（SSR）谐振器和微通道的LFICS，通过无光刻胶的阴影掩模沉积和蜡印刷技术克服了与工艺不兼容相关的难题，可用于稳定和定量的生物检测。该研究发表在《ACS Applied Materials & Interfaces》。

该研究提出的基于超材料的LFICS（meta-LFICS）由横向流动免疫层析组件、射频SSR谐振器和背板三个结构组件组成。侧流免疫层析组分由样品垫、结合垫、T线、控制线（C线）和吸附垫组成。为了控制分析物流向传感区域，采用蜡染技术制造疏水屏障和亲水通道，然后在膜上设计SSR谐振器作为敏感元件，用于传感通道中的生物分子。

研究人员对meta-LFICS进行了性能评估和稳定性分析，与RT-PCR相比，meta-LFICS成本较RT-PCR低，读写器更简单、更便宜，操作更简单，检测时间更短，从开始加载目标分子到测试结果结束总共只需要5分钟。与光学标记检测相比，meta-LFICS具有高的稳定性。

通过将超材料和微流体技术与LFICS集成，该研究展示了一种新颖的检测方案，可在ng/mL的检测限范围内稳定、定量地检测金黄色葡萄球菌。meta-LFICS的LOD和灵敏度分别达到0.784 ng/mL和10.214 MHz（ng/mL）。LOD水平是用肉眼可见彩色条LOD水平（50 ng/mL）的63倍左右，稳定而全面的检测方法克服了光学方法中自吸收、镜面反射和长期信号猝灭等干扰。

研究人员表示，该研究为定量检测金黄色葡萄球菌提供了强大的诊断工具。

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.9b02087

基于链置换触发G-四链体/RCA放大策略的电化学生物传感器

液体活检是一种非侵入性的肿瘤诊断手段，可以有效地监测肿瘤的发展和转移，探索肿瘤相关病变，而外泌体源性miRNA是液体活检的重要靶点，开发高特异性、高灵敏度的外泌体源性miRNA检测技术尤为重要。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授课题组开发了一种基于链置换触发G-四链体/RCA信号放大策略的电化学生物传感器，用于高灵敏和特异的检测外泌体源性miRNA。该研究发表在《Microchimica Acta》。

Toehold介导链置换反应（TMSDR）辅助磁珠分离技术可用于特异性检测外泌体源性miRNA，在特定条件下有效地完成特定目标序列的识别，因此，该研究所提出的传感器便利用TMSD辅助RCA将指示剂亚甲基蓝（MB）有效地固定在G-四链体中，产生级联放大电化学信号。

不同于目前大多数通过在金电极表面捕获miRNA来检测的电化学传感器，该传感器可通过以下步骤捕获目标miRNA，减轻电极表面的负担。

首先，将LNA修饰的捕获探针P1固定在磁珠上并与功能探针P2杂交。当靶miRNA从外泌体中分离出来时，LNA修饰的P1将捕获并通过TMSDR刺激功能探针P2的释放。重要的是，P2的一端将通过Phi29DNA聚合酶产生大量富含鸟嘌呤的序列，而另一端将与ssDNA杂交，以将RCA产物锚定到电极上。RCA产物随后与K+和MB一起孵育，信号指示剂MB嵌入由折叠的富含G的序列组成的G-四链体单元，以产生可测量的电化学信号。

RCA反应与G-四链体可产生级联放大电化学信号。在最适条件下，该电化学传感器对miRNA-21的线性响应范围为10fM～10nM，检测限为2.75fM，对miRNA-21的检测具有良好的特异性，可区别碱基对错配和其他miRNA。

研究人员表示，该电化学生物传感器在临床检测外泌体源性miRNA-21方面具有很大的潜力，可为癌症的早期诊断、治疗监测和预后评估提供了一种有效的改进策略。

文章链接：

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00604-020-4143-9

基于DNA纳米材料的双信号协同放大电化学生物传感器

循环miRNAs具有组织特异性来源、丰富的信息量等优点，DNA纳米材料具有显著的自组装能力和精确的识别能力，是开发多种生物传感器的有力工具，但miRNAs在细胞外环境中的丰度相对较低、体积较小，并且与其他miRNA序列同源，使得临床应用受到限制。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授课题组提出了一种基于DNA纳米材料的双信号协同放大电化学生物传感器，通过催化发夹组装（CHA）和三维DNA纳米网结构的耦合级联来实现循环miRNA的双放大电化学传感。该研究发表在《Analytica Chimica Acta》。

这种基于DNA纳米材料的双放大电化学传感系统包括两个信号放大过程，靶辅助CHA过程和自组装三维DNA纳米网结构。首先，通过Au-S键在裸金电极上修饰H1。随后，将miR-21和H2引入以诱导CHA反应。H1和H2探针之间的最小自发相互作用，无需发夹结构稳定的miR-21引发。一旦被miR-21触发，H1和H2会连续自主杂交，从而形成热力学稳定的H1-H2双链体。同时，miR-21被释放用于下一个周期，以实现第一次信号放大。

三维DNA纳米网结构与大量的三臂X-DNA单体连接，其中每个臂具有互补的粘端和磷酸基团，可与T4-DNA连接酶催化反应连接。三臂X-DNA的使用对于第二信号放大至关重要，从CHA过程产生的H1eH2双链体的尾部形成了X-DNA的第四臂，能够与三维DNA纳米网结构特异性杂交以实现第二信号放大。

此外，采用亚甲基蓝分子作为电化学探针，能够特异性地插层这些巨大的DNA双链体，因此亚甲基蓝的电化学信号与循环miR-21的浓度呈线性相关。

该生物传感器在优化的实验条件下运行，具有出色的分析性能，可检测循环miR-21，线性范围从10fM到1nM，检测限为3.6083fM，对单核苷酸和其他miRNA具有良好的特异性。

研究人员表示，该传感器可为miRNA相关疾病提供更有效、更准确的诊断和预后评估，希望这种精密的生物传感器可为基于DNA纳米材料的生物检测提供新的思路。

文章链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0003267020305134?via%3Dihub

全血标本生化指标检测的POCT平台

生化指标的定量检测在疾病诊断、健康状况评估和疾病进展监测中起着重要作用，然而检测仪器体积庞大、价格昂贵、只能在实验室特定地点环境中使用，导致检测效率相对低下。POCT在资源有限的环境中具有巨大的潜力，近几年在生化指标检测方面也取得了快速的进展。

日前，陆军军医大学西南医院检验科陈鸣教授团队联合中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所甘明哲教授团队研发了一个新的POCT平台，可实现全血生化标志物的定量检测。该研究发表在《Sensors and Actuators B: Chemical》。

该平台集成了血浆分离模块和检测模块。含有血浆分离条的血浆分离模块可以通过横向流动将血浆从全血样本中快速分离出来。检测模块生成一个色度信号，该信号可以由智能手机环境光传感器（ALS）的方式进行量化。

通过检测肝胆相关疾病的生化指标总胆红素（TBil）和直接胆红素（DBil），研究人员验证了该POCT平台与常规临床生化分析仪的检测性能，发现该平台的临床样品的定量检测性能与常规临床化学分析仪高度一致。表明在实际的临床全血样品检测中，该POCT平台可作为一种有效的定量工具。

此外，血浆分离模块可快速分离全血样本中的血浆，3D打印检测模块操作简单，无需使用移液工具，用于测量透射光强度的智能手机ALS显示出极高的灵敏度，与使用摄像头的信号读取分析相比，智能手机ALS平台不需要精确对焦，对散射光的影响很小，适用于不同品牌的智能手机。

研究人员表示，该POCT平台具有高便携性（重量<40g）、低成本（<5美元）、检测速度快（<5min）、无需仪器、灵敏度高（<1μM）准确率高（TBil为89.5%，DBil为94.7%）等特点，在资源有限的环境下进行生化标记检测的巨大潜力。

文章链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0925400520300976

专家简介

陈鸣教授，医学博士、教授、博士生导师，现任陆军军医大学药学与检验医学系主任、兼西南医院检验科主任。中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所客座研究员。中华医学会检验医学分会委员，中国中西医结合学会检验专委会常委，重庆市医学会检验专委会副主任委员，全军检验专委会委员兼分子生物学分委会主任委员。

《国际检验医学杂志》、《检验医学与临床》常务编委，《中华检验医学杂志》编委，《Biosens Bioelectron》等SCI杂志审稿人。作为课题负责人承担了国家863课题2项、国家自然科学基金重点项目2项、国家自然科学基金面上项目4项、卫生部专项课题1项、国家重大传染病防治专项子课题1项、军队“十二五”重大项目子课题1项、军队“十一五”攻关项目子课题1项、重庆市技术创新与应用示范重点项目2项、重庆市自然科学基金重点项目1项、重庆市基础研究课题1项。

获国家科技进步二等奖2项（2010-2、2016-5）、重庆市技术发明一等奖1项（2003-2）、军队科技进步二等奖5项（2017-1、2013-1、2012-7、2007-4、2002-4）、中华预防医学奖一等奖1项（2011-10）、中华医学科技奖二等奖1项（2009-3）。2018年获首批重庆市医学领军人才，同年入选陆军首批科技英才培养对象，2012年获第七届重庆青年科技奖，2010年获“重庆市十大杰出青年”，还获全国多媒体教育软件大奖赛一等奖1项（2010-1）、军队院校育才银奖1次、总后优秀教师1次、总后优秀网络课程二等奖1次，荣立三等功1次。

已在New Engl J Med，Science Advances等SCI杂志发表论文52篇，主编、参编专著5部。

第 101期前沿报道到此结束

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编辑：唐强虎 审校：方琪