新光学定位成像方法可观察大脑深层组织

江苏激光联盟导读：

据悉，来自瑞士苏黎世大学和苏黎世理工大学的研究人员开发出一种称为漫反射光学定位成像 (diffuse optical localization imaging, DOLI) 的新技术，利用它可以高分辨率、无创观察活体小鼠大脑深部的微血管。该技术具有卓越的分辨率，可看到深层组织，为观察大脑功能提供了强大的光学工具，在研究神经活动、微循环、神经血管耦合和神经退化方面具有广阔的应用前景。相关研究发表在近日的美国光学学会期刊Optica上。

光学成像历来在生物发现中发挥着重要作用，是显微观察的支柱。虽然各种荧光显微镜和断层扫描技术都能够进行体内深层组织成像，但光学衍射和生物组织的强光子散射所施加的基本物理障碍限制了可实现的分辨率和深度。突破光学衍射障碍是通过超分辨率方法实现的，例如随机光学重建显微镜和光激活定位显微镜。这些基于随机激活分子的定位或荧光团的选择性失活，允许以前无法实现的亚细胞结构细节可视化。通过利用点扩散函数 (point spread function, PSF) 的深度依赖性，进一步实现了三维成像，例如，由柱面透镜 或双平面检测形成。然而，另一个基本的分辨率和穿透障碍源于组织折射率的微小不均匀性造成的光散射。所谓的光扩散势垒在很大程度上决定了“弹道”光子可用于高分辨率成像的最大深度。非线性光学显微镜利用受散射影响较小的较长波长激发，而光学相干断层扫描进一步利用相干时间门控来拒绝散射光子，但活组织中可实现的成像深度仍约为 1-2 毫米。另一方面，已经建议基于自适应光学或波前成形的方法来突破这个深度障碍，尽管在超过1毫米的深度的体内适用性仍然具有挑战性。

▲图1. 漫射光学定位成像 (DOLI) 的概念和微滴的表征。(a) DOLI 设置的布局。单色激光束通过 SWIR 相机检测到的背向散射荧光照射隐藏在散射介质后面的荧光目标。(b) 用商业明场显微镜捕获的微滴的 WF 图像。(c) 微滴直径分布的直方图。(d) 定位和图像形成工作流程。(e) 用于测量 PSF 对散射介质中目标深度的依赖性的实验装置。(f) 用 SWIR 相机捕获的微流控芯片的 WF 图像。(g)记录的荧光 点大小（线轮廓的 FWHM）作为目标深度的函数；显示了原始数据和曲线拟合。

具有光学对比度的深层组织成像也可以通过结合光和声的混合方法来完成。特别是，与光相比，超声波在软生物组织中几乎没有散射，因此提出了几种声光方法，采用聚焦超声来调制相干光并在混浊样品内产生频移光源。然后，散射波前的检测用于通过时间反转光学相位共轭将光重新聚焦到声学焦点。然而，这些方法受到活组织中毫秒级散斑去相关时间的影响，阻碍了体内应用的潜力。另一个称为荧光和超声调制光相关性的概念是基于超声标记光与不透明样本内同一体素内定位的荧光波动之间的高度相关性提出的。此外，通过吸收光脉冲产生超声波的光声 (optoacoustic, OA) 成像已成为生物医学研究中的成熟工具。采用聚焦激发光束的光学分辨率 OA 显微镜方法的穿透力和空间分辨率同样受到光扩散障碍的限制。当在所谓的声分辨率范围内使用近红外波长的 OA 成像和未聚焦的光激发时，可以在厘米级深度进行 OA 成像。在后一种情况下，空间分辨率按成像深度的大约 1/200 的系数进行缩放。最近通过基于定位的技术（例如超声定位显微镜 和定位光声断层扫描）能够突破声学衍射障碍。请注意，OA 方法通常与基于荧光的技术不同，因为图像对比度主要与血红蛋白吸收有关，这可能会在存在血液强烈背景吸收的情况下影响外在标记的灵敏检测。

在该研究中，研究人员引入了漫反射光学定位成像 (diffuse optical localization imaging, DOLI) 来克服光子散射带来的障碍。该方法利用定位成像原理，在 NIR-II 光谱窗口中使用 SWIR 相机获取的一系列落射荧光图像中准确跟踪包裹硫化铅 (PbS) 基量子点的流动微滴，从而实现高分辨率荧光成像在光的漫射状态中。

这种技术利用了1000—1700纳米之间的第二近红外（NIR-Ⅱ）光谱，这一范围光谱的散射较少，可使显微荧光成像的深度达到光扩散深度极限的4倍。

在各种疾病的动物模型中，荧光显微镜经常被用来对大脑的分子和细胞细节进行成像。但此前，由于皮肤和颅骨的强烈光散射影响，荧光显微镜仅限于小体积和高度侵入性的操作。此次研究首次表明，3D荧光显微镜可帮助科学家以非侵入性方式，高分辨率地观察成年小鼠大脑。该显微镜有效覆盖了大约1厘米的视野。

对于这项新技术，研究人员通过静脉给一只活老鼠注射荧光微滴，其浓度在血流中形成稀疏分布。追踪这些流动的目标能够重建小鼠大脑深层脑微血管的高分辨率图。

这种方法消除了背景光散射，并且是在头皮和头骨完好无损的情况下进行的，有趣的是，研究人员还观察到相机记录的光斑大小与微滴在大脑中的深度有很强的相关性，这使得深度分辨成像成为可能。

▲图3. DOLI 小鼠经颅脑血管映射。(a) 去除头皮后通过小鼠脑血管系统的荧光染料灌注的 WF 图像。(b) 静脉注射微滴悬浮液后为同一只小鼠获得的相应 DOLI 图像。(c)、(d) (a) 和 (b) 中指示的 ROI 的放大视图。SSS，上矢状窦；ACA，大脑前动脉；MCA，大脑中动脉；TS，横窦。

▲图4. DOLI 小鼠的无创脑血管映射。(a) 荧光染料灌注后小鼠头部穿过完整头皮的 WF 图像。(b) 由微滴注射后获得的图像堆栈形成的相应 DOLI 图像。(c) 去除头皮后获得的大致相同 ROI 的 DOLI 图像。(d) 通过叠加有和没有头皮的 DOLI 图像来组合大脑和头皮的微血管图。ICV，大脑下静脉；SSS，上矢状窦；MCA，大脑中动脉；TS，横窦。(e) 来自三个 ROI 的微滴的代表性延时图像，用 (b) 中的实心橙色方块表示。(f), (g) 分别在有头皮和没有头皮的情况下记录的彩色编码 DOLI 深度图。深度估计基于图 1(g) 中所示的光斑尺寸到深度校准曲线。(h) (f) 和 (g) 中用白色虚线方块表示的 ROI 的放大视图。(i) 选定 ROI 中的深度统计数据（平均值±SD），如（f）和（g）中的白色实心方块所示。

研究人员首先在被称为组织幻影的组织合成模型中测试了这项新技术，该模型模拟了平均脑组织特性，证明他们可以在光学不透明组织中获得最深4毫米的显微分辨率图像。然后，他们在活体小鼠中进行了 DOLI，其中脑微血管系统以及血流速度和方向可以完全无创地可视化。

研究人员正在努力优化所有三个维度的精度，以提高 DOLI 的分辨率。他们还在开发更小、具有更强荧光强度并且在体内更稳定的改进型荧光剂。这将显着提高 DOLI 在可实现的信噪比和成像深度方面的性能。

Razansky表示，他们预计 DOLI 将成为在以前无法达到的深度和分辨率范围内对活生物体进行荧光成像的强大方法。这将大大提高荧光显微镜和断层扫描技术的体内适用性。

本文为江苏省激光产业技术创新战略联盟原创作品，如需转载请标明来源，谢谢合作支持！原文以"Diffuse optical localization imaging (DOLI) enables noninvasive super-resolution brain angiography in the second near-infrared window"发表在Optica (2021)上。