张锋团队开发新型RNA碱基编辑器：更小更便捷

撰文 | 木兰之枻

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CRISPR系统为基因编辑领域带来了革命性的突破。除靶向DNA外，研究者还发现，自然界存在可靶向RNA的CRISPR系统，它们可用于RNA的检测标记、表达调控、表观遗传修饰、疾病诊断、RNA定位以及RNA碱基编辑（详见BioArt报道：『珍藏版』综述 | RNA靶向的CRISPR系统——从宏基因组到RNA调控）【1】。已知的RNA靶向型CRISPR系统中，IV型CRISPR-Cas13系统最引人注目，并在RNA敲减及碱基编辑领域应用广泛【2-6】。体积是限制Cas13相关工具应用的关键因素之一，近年来多项研究关注于小型Cas13核酸酶的挖掘和开发，并取得众多成果（详见BioArt报道：Nat Methods 新工具| 杨辉团队发现和应用新Cas13X/Y系统进行高效的RNA编辑）【7】。

2021年8月30日，来自美国霍华德休斯研究所（HHMI）和Broad研究所的张锋实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Compact RNA editors with small Cas13 proteins的论文。文章通过数据挖掘找到多种超小型Cas13bt核酸酶，并以此为基础构建出可实现C-U和A-I突变的新型RNA碱基编辑器。新开发的RNA碱基编辑器具有体积小的优点，可通过单一的AAV载体系统递送，这将极大推动RNA碱基编辑器在基因治疗等领域的广泛应用。

为寻找体积更小的CRISPR-Cas13系统，研究者对原核和病毒基因组及宏基因组进行充分挖掘，并从中找到5843种潜在的系统，进而发现两种超小型的Cas13bt和Cas13ct亚型。这其中Cas13bt体积更小，大小为775-804氨基酸。考虑到Cas13b家族蛋白在哺乳动物系统中的RNA编辑活性更强，研究者后续重点关注Cas13bt亚型的分析与开发。

研究者首先在大肠杆菌中对Cas13bt的crRNA组分和靶向RNA的能力进行检测，结果显示Cas13bt1和Cas13bt3靶向RNA的能力最优。研究还指出，与已知的Cas13家族蛋白相似，Cas13bt3也具有旁切活性（指Cas13在切割目标RNA后仍保持活性，并可对非目标RNA进行无差别切割），这一特性是Cas13用于分子诊断技术研发的关键。

随后研究者对Cas13bt在哺乳动物细胞系中敲减目标RNA的能力进行分析，结果显示，在人源HEK293FT细胞中，Cas13bt1和Cas13bt3能有效敲减外源性和内源性的目标RNA，从而取得与RNAi类似的效果。

研究者还进一步将失活型Cas13bt1和Cas13bt3与RNA腺嘌呤脱氨基酶突变体（ADAR2dd）融合，构建出可介导A-I突变的RNA碱基编辑器REPAIR.t1和REPAIR.t3，以及介导C-U突变的RNA碱基编辑器RESCUE.t1和RESCUE.t3。研究还指出，Cas13bt为基础的RNA碱基编辑器可通过单一的AAV载体系统有效递送并实现特定碱基的精准编辑。最后，研究者还通过酵母定向演化系统对RNA碱基编辑器在RNA水平的脱靶效应进行优化，发现ADAR2dd的E620G和Q696L突变能有效降低RNA水平的脱靶效应。

总体而言，本研究以Cas13系统体积过大为切入点，通过数据挖掘和后续实验开发出新的超小型Cas13bt系统，并通过改造将Cas13bt用于RNA敲减和碱基精准编辑，实现了Cas13相关工具的小型化。本研究进一步丰富了RNA靶向的工具库，并将推动其在基因治疗等临床转化研究中的应用。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-021-01030-2

参考文献

1. Smargon, A.A., Shi, Y.J. & Yeo, G.W. RNA-targeting CRISPR systems from metagenomic discovery to transcriptomic engineering. Nat Cell Biol 22, 143–150 (2020).

2. Abudayyeh, O. O. et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature 550, 280-284, doi:10.1038/nature24049 (2017).

3. Cox, D. B. T. et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019-1027, doi:10.1126/science.aaq0180 (2017).

4. Konermann, S. et al. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell 173, 665-676.e614, doi:10.1016/j.cell.2018.02.033 (2018).

5. Yan, W. X. et al. Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein. Molecular cell 70, 327-339.e325, doi:10.1016/j.molcel.2018.02.028 (2018).

6. Abudayyeh, O. O. et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science 365, 382-386, doi:10.1126/science.aax7063 (2019).

7. Xu, C., Zhou, Y., Xiao, Q. et al. Programmable RNA editing with compact CRISPR–Cas13 systems from uncultivated microbes. Nat Methods 18, 499–506 (2021).