小“苹果”也有大作为：lncRNA编码的小肽APPLE调控恶性肿瘤发展

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　　通常认为，翻译产物是平均长度为449个氨基酸的蛋白【1】，但是传统的算法排除掉了潜在的小开放阅读框(small opening reading frame; sORF)所编码的长度小于150氨基酸的小肽。长链“非编码”RNA(long non-coding RNA; lncRNA)与mRNA结构相似，均具有5’m7G帽子和3’poly(A)尾，近年研究认为lncRNA是潜在的重要的小肽编码库【2,3】。尽管如此，lncRNA中大量存在的sORF是否编码小肽，以及这些小肽是否有生理功能或仅仅是翻译副产物仍有待研究。

　　在细胞内，蛋白合成是一个高度能耗过程，其调控网络非常复杂。在正常细胞中，翻译机器可以精确调控基因表达；而在恶性细胞中，近年的研究也逐步发现癌基因的转录活性与其蛋白丰度并不完全一致，提示翻译机器失调在细胞恶性转化中具有病因学地位【4】。尽管维持正常生理活动的管家mRNA可以在基础状态下被高效翻译，癌基因通常被认为是低效翻译的mRNA。因此，恶性细胞中蛋白合成机器失调所引起的特异癌基因翻译增强对于推动细胞恶性发展十分重要。其中，翻译起始是整个翻译过程的限速步骤，包括poly(A)结合蛋白PABPC1和起始因子eIF4G介导的mRNA环化以及eIF4F起始复合体组装等过程，是恶性细胞中翻译机器的关键调控节点【5】。然而，恶性细胞如何利用翻译机器来特异性增强癌蛋白的合成仍不清楚。理解这一过程不仅有助于了解细胞内复杂的翻译调控网络，也可以为靶向癌症治疗提供新的理论基础。

　　2021年9月22日，中山大学生命科学院陈月琴团队在Molecular Cell杂志上在线发表了题为The oncomicropeptide APPLE promotes hematopoietic malignancy by enhancing translation initiation的研究论文，该研究通过结合多组学数据筛选鉴定到了一批lncRNA编码的小肽，并进一步通过siRNA功能筛选发现其中一个定位于内质网的小肽APPLE(a peptide located in ER)对于恶性肿瘤发展十分关键。APPLE是一个新的翻译起始调控因子，可直接结合poly(A)结合蛋白PABPC1和起始因子eIF4G并增强两者的互作，从而促进eIF4F起始复合体的组装和mRNA环化。通过这种方式， APPLE可以增强细胞分化、增殖和凋亡关键通路中特异癌基因的蛋白合成，如KRAS和PIM1等，从而加速细胞恶性转化进程。

　　首先，作者结合了多种组学数据，筛选出可结合到在核糖体上(Ribo-seq)、有对应的sORF编码肽段(mass spectrometry)以及恶性细胞中差异表达(RNA-seq)的lncRNA，并进一步对这些lncRNA进行siRNA功能筛选，结果发现潜在编码小肽的ASH1L-AS1对恶性细胞发展十分重要。通过外源过表达、原位knock-in，以及质谱鉴定等多种手段，作者证实ASH1L-AS1的ORF6阅读框的确编码一个小肽。进一步的细胞定位分析发现此小肽位于核糖体富集的内质网上，并命名为APPLE。

　　通过对编码APPLE的ASH1L-AS1基因进行表达分析发现，ASH1L-AS1在恶性血液肿瘤中表达最高，并且在多个亚型中均呈显著高表达趋势，与不良预后密切相关。对临床样本的进一步分析发现，其编码小肽也呈现一致的高表达模式。据此，作者在体外细胞模型及体内小鼠模型验证均发现靶向APPLE可以有效缓解癌症发展，延长小鼠生存时间。重要的是，作者通过回复实验发现外源表达APPLE可以有效回复ASH1L-AS1敲低表型，而表达小肽起始密码子突变的ASH1L-AS1转录本无法回复表型，这提示小肽APPLE而不是其sORF所在的RNA转录本发挥以上功能。

　　为了探究小肽的作用机制，作者通过免疫共沉淀后蛋白质谱鉴定的方法发现APPLE的互作蛋白富集于翻译过程。结合APPLE的亚细胞定位，提示小肽可能参与这一过程。为了验证这一点，作者结合SUnSET和polysome profiling等多种实验得出APPLE可以调控翻译起始步骤，促进蛋白合成。值得注意的是，根据APPLE互作蛋白质谱鉴定结果，作者进一步通过细胞内分子实验和体外生化实验发现APPLE特异结合mRNA poly(A)结合蛋白PABPC1和起始因子支架蛋白eIF4G，并且促进两者的互作。

　　有趣的是，通过对PABPC1蛋白不同结构域进行删除突变后发现，删除RRM1和RRM3结构域后，APPLE与PABPC1的互作均明显减弱，但只有当两个结构域同时删除后， APPLE与PABPC1互作才会消失。以往的研究发现尽管PABPC1与eIF4G的作用结构域为RRM2，但RRM1和RRM3促进两者的结合，提示可能存在未知的因子介导PABPC1和eIF4G的互作。基于以上结果，作者提出APPLE结合在PABPC1 RRM1和RRM3结构域，从而像“铆钉”一样稳固相邻的eIF4G与PABPC1的互作。鉴于PABPC1-eIF4G互作促进mRNA环化,作者进一步通过luciferase报告系统和m7G pull-down实验验证APPLE可以辅助mRNA环化，并且促进eIF4F起始复合体组装。此外，作者也通过多种回复实验表明APPLE而不是ASH1L-AS1转录本发挥调控翻译起始功能，这与之前的功能实验结果一致。

　　最后，作者通过Ribo-seq组学分析发现APPLE可以特异性地增强与细胞分化，增殖和凋亡密切相关的癌基因的翻译，并利用细胞系和原代细胞进行了进一步验证。同时，作者通过外源表达APPLE下游癌基因，如KRAS或PIM1，可回复APPLE敲低表型证明了APPLE通过增强特异癌蛋白的合成促进恶性细胞发展进程。

　　综上所述，作者发现了一个长链“非编码”RNA来源的小肽在翻译起始调控过程中的全新功能。这项研究不仅拓展了我们对功能性小肽参与的多样化细胞过程的认识，也为翻译调控网络及其在恶性细胞中的失调提供了不同的角度。鉴于APPLE在多种血液癌症亚型中的特异高表达和广泛性功能，靶向小肽抑制致癌蛋白合成可以为异质性高的癌症治疗提供潜在的分子靶标。

　　中山大学生命科学学院孙林玉博士、王文涛副教授和韩才博士为本文共同第一作者。陈月琴教授为本文的唯一通讯作者。本研究也得到中山大学附属第一医院罗学群教授的帮助。

　　原文链接：

　　https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.033

　　参考文献

　　1 Zhang, J. Protein-length distributions for the three domains of life.Trends Genet.16, 107-109, doi:10.1016/s0168-9525(99)01922-8 (2000).

　　2 Makarewich, C. A. & Olson, E. N. Mining for Micropeptides.Trends Cell Biol.27, 685-696, doi:10.1016/j.tcb.2017.04.006 (2017).

　　3 Ruiz-Orera, J., Messeguer, X., Subirana, J. A. & Alba, M. M. Long non-coding RNAs as a source of new peptides.eLife3, e03523, doi:10.7554/eLife.03523 (2014).

　　4 Truitt, M. L. & Ruggero, D. New frontiers in translational control of the cancer genome.Nat. Rev. Cancer16, 288-304, doi:10.1038/nrc.2016.27 (2016).

　　5 Bhat, M.et al.Targeting the translation machinery in cancer.Nat. Rev. Drug Discov.14, 261-278, doi:10.1038/nrd4505 (2015).

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