“当你在观察一种免疫反应的时候，这些免疫细胞到底是在攻击肿瘤细胞，还是在攻击感染了冠状病毒的细胞？这个问题可以通过空间技术找到答案，这是以前的技术所无法实现的。” 空间生物学公司 Vizgen 的试剂研发副总裁说。
空间技术有丰富的历史，Mats Nilsson、George Church 等人各自的实验室进行相关的研究已有十多年。由于单细胞技术的发展，分析工具的拓展使得空间分析在过去一两年逐渐发展成为一个大领域。根据 Research And Markets 的数据，空间生物学未来 7 年市场将以每年 10% 的复合增长率不断扩大。
空间转录组学技术是生命科学和医学领域振奋人心的技术突破之一，被 Nature评为 2020 年 “年度技术”。去年研究人员利用空间转录组学等技术分析了 24 名新冠患者的尸体标本。这一领域不仅发文数量激增成为 “学术爆款”，应用方向和产业落地进展也不断加速，种种进步对于理解细胞生物学、发育生物学、神经生物学、肿瘤生物学等关键方面都至关重要。
有科学家举过这样一个例子，如果把多细胞批量测序比作思慕雪，那么单细胞测序就是水果沙拉，空间转录组学就像是水果塔，可以知道每个水果的确切位置，以及不同水果之间的关系。如果有一天可以实现活组织中单细胞的时空组学，那么单细胞的发展将会进入一个完整的循环。
技术繁多，需要标准化程序
在生物学中，空间概念被用来描述交互式的生物网络，具有重要的意义。
技术发展的一个驱动力是一些正在进行的大型和做研究，以创建全面和公开可用的数据集。同时也需要开发新的分析工具和标准化程序，以便能够将不同的技术结合起来。
目前，空间分辨转录组学技术可按照不同方法分为五个类别：基于显微切割的基因表达技术、原位杂交（ISH）技术、原位测序（ISS）技术、原位捕获技术以及空间数据重构。
图丨空间分辨转录组学技术发展时间表（来源：BioEssays）
捕捉空间基因表达信息的最直接方法是从样本中分离出目标区域，然后将这些区域单独放入试管中进行 RNA 提取和后续的基因表达谱分析。基于 “分块检测” 的技术思想，利用显微切割术检测基因表达应运而生。
虽然解剖单个区域进行后续的测序可以完整地提取不同形式的 RNA 种类，但对于较大的检测区域来说，操作步骤过于繁琐，而且想要获得整个组织中的整体图像通常不太可能。
图丨基于不同操作手段的显微切割的基因表达检测使用原理（来源：BioEssays）
为了能够在原始环境中直接观察 RNA 分子，1980 年代，人们开始使用携带荧光标记的探针与特定的 RNA 分子杂交。
基于图像的原位杂交技术（ISH）的问题在于，当同时检测更大的不同转录本时，光谱重叠是关键限制，需要更高明的解码策略以便提升解读；此外，更多种类的特异性探针也不可或缺。
最开始，原位杂交法仅靶向于单个 RNA 的不同区域（smFISH）；到了 2015 年，具备了组合标签、连续成像技术的 MERFISH 已经可以鉴定单个细胞中数千种 RNA 的拷贝数和空间走位。
2011 年，Advanced Cell Diagnostics 推出了商用 RNAscope 分析仪。其方法核心在于探针设计，两个相邻的 “Z 探针” 与目标 RNA 转录物结合，形成所需的结合位点，以便后续逐步地放大信号。2019 年 7 月，该设备同时检测的 RNA 靶点最大数量增加到 12 个。低倍数 RNAscope 还与成像质粒细胞仪（IMC）结合使用，可用于同时进行地 mRNA 和蛋白质评估。
2019 年，一种被称为 "DNA 显微镜" 的核苷酸无光学定位技术进入大众视野。该技术利用测量距离的方式评估核苷酸的热力学熵，从而将获得与传统的成像方法相反的特征结果。迄今为止，该技术仅对培养细胞上的一小部分转录本进行了演示。
与 ISH 技术类似，原位测序技术是通过对组织环境细胞中的 RNA 进行测序从而实现快速的可视化。以上描述的空间组学技术要么基于部分组织的分离分析，要么基于通过杂交或测序对 RNA 分子进行原位可视化。
而原位捕获技术的重点在于原位捕获转录本，然后进行异位测序。该技术能够直接避免此前可视化技术的固有限制，并允许对完整的转录组进行无偏见的分析。
2016 年，以原位捕获技术为基础，空间转录组学（ST）技术第一次发布在 Science 杂志上。该技术原理包括：以 x 和 y 固定组织切片坐标，使 mRNA 分子垂直向下扩散并与条形码引物杂交。随后提取 cDNA-mRNA 复合物用于文库制备和 NGS 读数，再将所读取的内容叠加回组织图像上。
图丨原位捕获技术原理（来源：BioEssays）
利用该技术，可以获得全转录组水平的基因表达及位置信息。2018 年底，ST 技术被 10X Genomics 公司收购并进一步开发，命名为 "10X Visium"。此后，建立在 ST 技术基础之上，多种原为捕获空间转录组学技术被探索开发，如 HDST、GeoMx DSP、Slide-seq 等。
除上述方法之外，空间数据重构可以充分利用内在基因表达模式或共表达的趋势，从单个细胞的大量转录组数据中重构细胞间的环境。然而，这种推论方法在某些情况下仅呈现空间趋势或特定组织的总体布局。
图 | 空间转录组学技术的对比（来源：Spatially resolved transcriptomics and its applications in cancer）
基于各类空间分辨转录组学技术的高速发展，推动该领域前行的一个重要因素是不断进行合作性研究，利用不同技术之间的有效集成，从而创建全面且公开的图谱。
最先在脑疾病领域大展拳脚？
从 PubMed 的检索信息可以看出，今年的空间转录组学论文发表数量激增，截至 10 月，数量已经超过了去年全年。
基因表达具有时间特异性和空间特异性，时间特异性可以通过不同时间点的取样和单细胞转录组测序技术进行分析。但空间特异性往往难以分析。常规的转录组测序和单细胞转录组测序无法还原细胞的原始位置信息，而传统的原味杂交技术又很难实现高通量检测。
空间转录组学的火爆不是没有道理。相比于常规的测序手段，空间转录组在测序方面具备定位精准、高效易行、适用性广的特性和优势。
“空间转录组学可以提供高分辨率，加深我们对细胞在组织内相互作用的理解，” Illumina 的科学创始人 David Walt 表示 ，“之前的方法能够为我们提供组织异质性的图片，但要实现细胞和亚细胞水平分辨率，不仅需要更好地了解生物学，还需要深入了解疾病。”
10X Genomics 负责研发的高级副总裁 Michael Schnall-Levin 认为，空间转录组学可能在神经科学领域最先起步。其他对空间分析较为敏感的领域还包括发育生物学，以及癌症研究，癌症研究中尤其是评估肿瘤异质性的 T 细胞浸润。
美国国立卫生研究院科学基金会正在资助一个 “脑细胞普查网络计划”，诸多实验室合作共同绘制大脑图集，空间转录组学在其中发挥了重要作用，依托 “美国科学院最年轻华人院士” 庄小威的 MERFISH 工具，在单细胞水平上实现空间分辨的高度多重化 RNA 分析，在 2mm×2mm×0.6mm 的脑块中检测了超过 100 万个细胞，不仅识别了 70 多种不同类型的神经元，而且还精确定位细胞所在的位置及其各种功能。
MERFISH 的共同开发者、波士顿儿童医院助理教授 Jeffrey Moffitt 说：“我们所知道的大脑是非常有空间组织的。到目前为止，我们还无法了解存在的细胞类型，也无法绘制它们的空间组织图，我们需要了解这些细胞类型在不同的生物状态下是如何变化的，而空间组学能够给我们提供这些信息。我认为这将引导我们了解神经系统疾病并且开始真正开发治疗它们的疗法。”
除了了解大脑以外，在肿瘤领域，了解肿瘤的空间特异性，尤其是在只有有限的肿瘤物理采样的情况下，将会对指导治疗有重要的助力。
尽管拥有广泛的应用场景，不过当下的空间转录组学仍需在空间分辨率、每次测量的数据深度、吞吐量、成本和复杂性方面不断优化。
巨头环伺但新锐群出
总的来看，空间转录组技术还只是应用在基础研究领域，不过，这些技术极具潜力成为个性化医学的重要工具。前提是，需要解决工作流程复杂、以及成本较高等问题。业界期待一种单细胞水平的空间转录组学的商业解决方案。
商业化 ISS 和 SPBC 技术的出现，将该推动该技术更广泛的应用。SPBC 由于其相对简单、采用门槛低、工作流程与临床病理技术相似、与组织学成像兼容，更适合临床应用。
图 | 10X Genomics 平台 Visium 可直观地绘制组织样本中的基因表达图（来源：10X Genomics）
10X Genomics 是空间转录组学领域规模最大的公司。一些大学和医院已经建立了提供 10X Visium 服务的核心设施。
该公司通过两次重大收购 “杀入” 这一领域，收购带来了 110 项专利，并在此基础上建立了 Visium 平台。利用 Visium，研究人员可以从整个组织切片和各种各样的样本类型中获得整个转录组高通量基因表达分析结果。该解决方案使研究人员能够揭示正常和患病组织的生物学结构，并发现新的组织生物标志物。
图 | 操作流程
具体到操作流程：
- 新鲜冰冻组织标本切片放置在载玻片的四个捕获区，每个区域一张切片
- 利用标准的固定和染色技术在载玻片上对组织切片进行染色
- 组织透化（在细胞上打小孔），从细胞中释放出 mRNA，mRNA 与 spot 上存在的空间条形码寡核苷酸结合
- 反转录，合成 cDNA 的第二条链并变性
- 带有 barwxxxcode-styledde cDNA 被收集起来用于建库
- 建好的文库再用测序仪进行测序
Nanostring 是一家新兴的生命科学公司，它利用光学分子条形码技术打造了一个空间分子成像平台，可以分析组织样本中单个细胞的 RNA 和蛋白质。该平台基于该公司的 Hyb＆Seq 化学技术，应用于肿瘤学、免疫学、神经科学和发育生物学。其直接竞争对手是 Fluidigm 和 Ionpath。
Vizgen 也是该领域的一颗新星。该公司使用分子条形码技术，可以在单细胞水平上定量 RNA 水平。这是基于 Moffitt 共同发明的 MERFISH 技术：一种多重 RNA 成像技术，可以检测成千上万个分子。
在国内，华大基因研究中心也在开发一种高分辨率的基因表达分析方法，并且认为华大基因的分辨率位居诸多公司前列。华大基因公司已经为小鼠大脑的空间分析制造了芯片，每个纳米球大约有 2000 个基因和 4000 个转录基因。公司最终想建立人类和模式生物的参考组织图，使研究人员可以利用这种空间技术来评估基因变异如何影响组织功能 (如在癌症中) ，或者将其用于跨物种比较方法，如基于组织的器官结构进化和适应的研究。
交互式可视化工具也是空间转录组学公司的一大追求，因此，软件开发人员是此类公司里的刚需。
图 | 利用 MERFISH 技术，哈佛大学的研究人员在人类癌细胞的单个细胞中捕获了 10050 个基因的表达。不同基因的 RNA 分子以不同的颜色显示（来源：Zhuang Lab）
全球知名的 Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN) 杂志在 40 周年之际采访了数十位 biotech 领域学界、产业界和商业界的专业人士，有多位专家提到了空间技术。Nanostring 的首席科学官甚至这样形容：空间多组学将是革命性的，它甚至在重要性上超过了下一代测序。GEN 的高级科学作家 Julianna LeMeiux 也称，下一波基于基因组的技术，如空间转录组学和 DNA 编写，都将引领各自的革命。
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