莲花飞白堤：巧记 ELISA 常见问题及解决方案

酶联免疫吸附测定法（ELISA）是蛋白定量金标准，灵敏度高（可达 pg/mL）、特异性强、重复性好，且操作简单，检测仪器易获得（酶标仪），是免疫学中的常规手段。

但是 ELISA 也是一种细节决定成败的实验，了解操作中的常见问题可以有效避免踩坑，使实验能够达到事半功倍的效果，早日获得科研结果。

火眼金睛

5 招教你判断试剂盒真假

买对 ELISA 试剂盒是成功的第一步。进口 ELISA 试剂盒超贵，国产的各种品牌良莠不齐，一旦买到假的试剂盒，拿到错误的实验结果，后果不堪设想。那应该如何判断试剂盒真假，下面几招请牢记～

购买前

向厂家索要或从其网站下载说明书，查找 ELISA 的性能指标：准确度（加标回收率、稀释线性）、精密度（板内差、板间差）、灵敏度、样本值、特异性、校准等。一般来说，除了校准不一定每份说明书都有外，其余的指标一般都需要罗列（部分样本需要高倍稀释，可能没有准确度这个指标）。如果无法提供这些性能指标，则说明该试剂盒可能是假货，或者试剂盒开发过程不够科学严谨，有可能无法检测出真实的样本值。

对于 ELISA 指标齐全，种属多样（特别是不常见种属）的商家，可先去搜索想要购买指标是否有抗体出售，如果抗体都难以买到，则 ELISA 有可能是假货，需要小心谨慎。

将「厂家名」、「ELISA」和「假货」等关键词在网上搜索，有的网站或论坛如丁香园等会有打假曝光台。

购买后

利用干扰实验即可鉴别 ELISA 试剂盒是否可检测目的抗原。

如果购买了两盒同一公司的 ELISA 试剂盒 A 和 B，利用交叉实验即可鉴别 ELISA 试剂盒是否造假。

心细如发

4 表掌握 ELISA 操作常见问题及解决办法

在确定 ELISA 试剂盒为真的情况下，应严格按照说明书进行操作，比如使用干净容器和要求的水质配置缓冲液等，主要注意要点如下：

移液操作时，酶标板孔中要垂直悬空加入液体，避免加到孔壁上。

实验前将所有试剂平衡至室温。

标准品粉末溶解前需要先短暂离心，使管内标准品全部集中在管底。

实验要做复孔，减少误差。

振荡孵育，加强反应。

每次洗板必须将洗液弃干净。

酶标仪检测前预热，双波长检测。

注意显色判断，适时终止。

但有时即使完全按照说明书操作，仍然会出现诸多问题，可以按照问题类别逐一进行排查。

1. 白板

如果显色完成后，肉眼可见整板没有显示反应，可能原因及应对方法详见表 1。

表1 异常白板排查及应对方法

序号

原因

对策

1

试剂盒储存不当，试剂失效；不同试剂盒试剂混用

购买新的试剂盒，注意储存条件；不可混用

2

孵育温度低，时间短

如果温度偏低，则延长孵育时间和显色时间

3

错加、漏加试剂

严格按照说明书步骤添加正确试剂

4

用于配置溶液的容器不干净，或水有问题，比如含有抑制酶活的 乙二胺四乙酸（EDTA）、叠氮化钠等

使用干净容器以及合格的蒸馏水

5

检测抗体和/或辣根过氧化物酶（HRP）浓度太低

参照说明书，不可随意稀释

6

试剂温度不均一

所有试剂要室温平衡 30 min

7

洗板过程中浸泡时间长，洗板次数太多，洗板冲击力大

按说明书操作

2. 花板

花板是指空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的吸光度（OD 值）却明显偏高，可能原因及应对方法详见表 2。

表 2 异常花板排查及应对方法

序号

原因

对策

1

洗涤次数少，不充分

按说明书要求洗涤

2

底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB ）被金属离子或氧化剂污染或曝光

配置时使用干净容器以及合格蒸馏水；避光保存

3

孵育温度高和/或时间过长

控制孵育和最后酶促反应的温度和时间

4

加样时未更换枪头，造成交叉污染

每个样都更换枪头

5

附近孔交叉污染

洗涤时，洗液不可溢出孔洞，垂直拍板，使用合适的拍板纸，避免孔内进入纸屑尘渣；孵育时封板要严密，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致花板的出现

6

样本存在内源性干扰物质

推测可能的感染物质，并进行对应处理

7

样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血管中添加物影响等

避免溶血、污染、过久储存等现象

3. 标曲不佳

ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释，但标准曲线最高点 OD 值偏高或偏低，且没有梯度，可能原因及应对方法详见表 3。当然，也会存在酶标板封闭不足、本底不稳定的情况。

表 3 标曲不佳排查及应对方法

结果

可能原因

解决方法

标曲最高点 OD 太高（> 3.0）

TMB 孵育时间太长

调整孵育时间

指纹、杂质影响

双波长检测，去背景

标曲最高点 OD 正常

标准品进行下一步稀释前没有混匀

先混匀，再移液

不同试剂盒或不同批号的试剂混用

不能混用

检测抗体浓度过高

按照说明书调整到最佳浓度

孵育时未加盖导致溶液挥发和污染

贴封片或加盖

孔间污染

加样及洗板时防止孔间污染

标曲最高点OD偏低（< 0.8）

显色时间不够

S1、S2 深蓝色，有明显梯度，S5 有淡蓝色时可终止

粉末标准品未充分溶解

粉末标准品按说明书加一定体积的液体后，轻柔混匀，室温静置 30 min，充分溶解

标准品反复冻融

标准品反复冻融后活性降低；购置新的标准品

孵育温度、时间

所有试剂室温（~25 ℃）平衡 30 min，孵育时间按照说明书指示

洗涤浸泡时间过长

按照说明书操作，勿人为增加浸泡时间

酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥

防止板过于干燥

不同试剂盒或不同批号的试剂混用

不能混用

显色液变质

更换新的显色液

4. 标曲正常，样本吸光值极低

标曲正常，但是样本读值极低，甚至有低于空白孔的情况，可能原因及应对方法详见表 4。

表 4 样本读值极低排查及应对方法

序号

原因

对策

1

样品不适合做 ELISA 检测

样品一般选择培养上清、血清、血浆。

其他样品形式可能不适合做 ELISA 检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）

2

样本含量低于灵敏度

尝试浓缩样本或使用高敏试剂盒，避免反复冻融

3

样本存于吸附性强的试管中，导致蛋白含量下降

选择蛋白吸附能力低的硅化 EP 管

4

冻融后，蛋白凝集，分布不均

混匀，避免产生气泡

5

样本反复冻融，导致抗原滴度下降

样本避免反复冻融

此外，如果肉眼观察酶标板显色正常，而上机所测 OD 异常，可检测酶标仪参数的设定以及滤光片是否匹配。洗涤液多为非离子型中性缓冲液，既含有亲水集团，也含有疏水基团，可以使吸附在酶标板上的蛋白解离而溶于水中，去除非特异性吸附物质，但是浓度太高时，会引起包被抗体脱落。所以需要正确稀释。同时应该用高质量的纯净水稀释，不能引入别的离子，以免对抗原抗体结合和酶促反应产生影响。

写了这么多，记不住怎么办呢？其实只有五点：

1. 选择品牌试剂盒比如联科生物
2. 花板
3. 标曲不标准，主要是最高点飞来飞去不稳定
4. 白板
5. 标曲正常，样本吸光值极低

再简单五个字就搞定了：

莲花飞白堤

是不是有点西湖的意境了？莲谐音联，联科生物坐落于杭州，专注于 ELISA 检测试剂的生产和研发，提供高品质的 ELISA 检测产品和服务，依托在生物试剂领域近 20 年的技术积累，为客户提供高效的检测服务。

联科生物的 ELISA 多重验证实验不但是试剂研发成本中的重要组成部分，而且验证指标越多，对工艺要求越严格。

联科 ELISA 试剂盒有通用和高敏两款产品供选择，价格亲民，大量现货能够在 3 日内发货。

内容策划：武妙兰
内容审核：周文

题图来源：站酷海洛

内容来源：联科生物