《食品科学》：麦胚清蛋白抗氧化肽的筛选及对细胞氧化损伤的保护作用

活性氧自由基（ROS）是机体代谢产生的一类氧化自由基，自由基过量或不足都会影响机体内环境的稳定。生物体内抗氧化防御系统主要由内源性抗氧化剂（谷胱甘肽（GSH）等）和抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化物酶等）组成，能够维持机体正常的ROS代谢平衡，使ROS的产生和清除处于动态平衡，保护机体不受氧自由基的侵害。当机体处于糖尿病和肥胖症等代谢紊乱状况下，无法清除自身的多余自由基，致使自由基过量累积，从而导致氧化应激。

小麦胚芽是小麦粉加工的副产物，含有质量分数约30%的麦胚蛋白，其中，麦胚清蛋白（WGA）的酶解产物由于具有较强的抗氧化性，其在功能食品开发领域研究较多。南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室的张 羽、宋海昭*、沈新春*等人在之前的研究中通过响应面法优化WGA制备抗氧化肽条件，发现中性蛋白酶（底物质量分数为2.4%、加酶量5 900 U/g、酶解pH 7.04、酶解温度55 ℃、酶解时间4 h）为最佳用酶。基于此，该课题组以WGA中性蛋白酶酶解产物为研究对象，通过超滤、凝交过滤层析、离子交换层析等技术对WGA酶解物（WGAH）进行逐级分离，根据各级分离产物的抗氧化活性筛选具有较高抗氧化活性的目标肽段，鉴定其氨基酸序列，并结合PeptideRanker数据库活性预测结果筛选出抗氧化活性最高的肽序列，进一步采用高糖诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）及H2O2诱导的HepG2和VSMCs建立细胞氧化损伤模型，检测其生物活性，旨在为麦胚抗氧化肽产品的开发提供理论参考。

1、超滤法分离麦胚清蛋白酶解物

如表1所示，WGAH及其组分的分子质量和抗氧化活性具有显著的负相关性。WGAH超滤得到的3 个组分的抗氧化活性随着分子质量的减小而升高，其中WGAH-III组分抗氧化活性最高，其ORAC为1 258.98 μmol TE/g，ABTS阳离子自由基清除率为62.27%，分别为WGAH的1.14 倍和1.15 倍，是酶解前WGA的1.41 倍和2.68 倍（P＜0.05）。结果表明，WGAH分子质量越小，其抗氧化活性越高。

2、WGAH-III组分的层析分离

如图1A1所示，可以看出WGAH-III组分经过Sephadex G-75分离后，得到5 个洗脱峰，分别为峰A、B、C、D、E。收集冻干后，分别测定5 个峰的ORAC，结果如图1A2所示，C、D组分的ORAC最高且无显著性差异。此外，ABTS阳离子自由基清除率结果显示D组分的ABTS阳离子自由基清除率为81.04%，明显高于C组分（71.85%）（数据未列出），因此本研究选择D组分进行Sephadex C-25阳离子交换柱分离。

如图1B1所示，WGAH-III-D组分经过Sephadex C-25阳离子交换柱分离后，分离得到3 个峰，其中峰2的强度较高，分别对分离得到的3 个峰进行分段收集，脱盐冻干后，进行ORAC抗氧化能力的测定，结果如图1B2所示，峰2的ORAC抗氧化能力最高，峰3活性最低。该结果表明，经离子交换色谱分离，峰2具有最强的抗氧化能力。因此选择峰2组分进行Sephadex G-25凝交柱分离。

Sephadex G-25凝交柱可分离的分子质量为1～5 kDa，如图1C 1 所示，Sephadex G-25凝交柱对组分WGAH-III-D-2分离得到5 个峰，分别收集冻干后测定ORAC。如图1C 2 所示，V组分的ORAC显著高于其他4 个组分（P＜0.05），说明其抗氧化能力最强，这说明分子质量最小的V组分具有最高的抗氧化活性。因此，选取组分WGAH-III-D-2-V进行进一步研究。

3、凝交柱层析产物的结构鉴定与PeptideRanker数据库预测

如表2所示，这些肽均由6～10 个氨基酸组成。大量研究证实这种由10 个以下氨基酸组成短肽的抗氧化活性要高于其母蛋白及多肽，因为在蛋白质水解的过程中，肽链断裂使具有高抗氧化活性的肽段暴露出来，有利于清除自由基、螯合过氧化金属离子和抑制脂质过氧化。本研究通过PeptideRanker数据库对这20 种短肽进行活性预测分析。PeptideRanker是一个较为系统的肽数据库，设置阈值为0.50，即预测值为0.50以上的肽被认为具有生物活性，且值越大生物活性越高。根据PeptideRanker数据库活性预测结果，按其活性指数排序，并选取活性最高的8 种肽序列进行人工合成以进一步验证其抗氧化活性。

4、活性肽的筛选

如表3所示，LNYPPY具有最高的ORAC（3.01 μmol TE/μmol）且清除ABTS阳离子自由基活性最强，清除率为95.58%。许多研究表明，肽的生物活性取决于氨基酸序列，氨基酸种类，以及分子质量。较小分子质量的肽具有较大的生物活性。多肽中氨基酸的特定位置影响其生物活性，当多肽的末端含有疏水性（Leu、Val和Gly）和芳香族氨基酸（Phe和Tyr）时，具有较高的抗氧化活性。肽序列中，疏水性氨基酸（Leu、Val和Gly）、亲水性氨基酸（Pro）以及芳香族氨基酸（Phe和Tyr）的存在有助于其总体具有较高的抗氧化活性。

如表3所示，YDWPGGRN与LNYPPY都具有较高的自由基清除能力，推测与末端的Tyr有关，且LNYPPY含有两个Tyr。其次，肽序列LNYPPY具有最强的抗氧化能力，与其N端具有较强疏水性和较低带电性的Leu有关且其分子质量较小。因此，选取LNYPPY进行下一步研究，LNYPPY二级质谱图如图2所示。

5、LNYPPY对细胞氧化应激损伤作用的影响

如图3所示，高糖能诱导VSMCs ROS水平极显著上升并使细胞异常增殖（P＜0.01），抗氧化肽LNYPPY的添加并没有显著抑制高糖诱导的VSMCs的异常增殖和ROS产生，说明LNYPPY对高糖诱导的VSMCs氧化应激损伤无保护作用。

本研究选取不同浓度的H2O2（浓度梯度为25、50、100、150、200 μmol/L）对HepG2细胞进行诱导损伤，如图4A所示，加入H2O2处理12 h后，H2O2对HepG2细胞存活率的影响呈现明显的剂量依赖效应。当50 μmol/L H2O2刺激HepG2细胞时，可极显著抑制HepG2细胞的增殖（P＜0.01），当H2O2浓度为150 μmol/L时，HepG2细胞存活率降至50%，因此选择添加150 μmol/L H2O2的HepG2为细胞氧化损伤模型。如图4B所示，在150 μmol/L H2O2诱导处理的HepG2细胞中添加抗氧化肽LNYPPY共同培养后，随着抗氧化肽浓度的增加（5、10、20、40 μmol/L），细胞存活率随之提高，且抗氧化肽处理组（10、20、40 μmol/L）与模型组相比具有极显著性差异（P＜0.01），说明抗氧化肽LNYPPY能够有效改善由H2O2诱导HepG2细胞的活力降低。如图4C所示，当H2O2浓度为150 μmol/L时，HepG2细胞ROS水平是正常细胞的3.26 倍，加入抗氧化肽LNYPPY后，随着肽浓度的增加（5、10、20、40 μmol/L），ROS水平极显著下降（P＜0.01），当肽浓度为40 μmol/L时，该条件下ROS水平降至正常细胞的1.47 倍。说明抗氧化肽LNYPPY能够有效的减少由外源性H2O2引起的HepG2细胞ROS异常增多的现象，对HepG2细胞氧化损伤具有保护作用，从而维护细胞的代谢平衡。

本研究还探讨了LNYPPY对H2O2诱导的VSMCs氧化损伤的作用。当H2O2浓度为200 μmol/L时可使VSMCs存活率降低幅度大于30%，因此选择200 μmol/L H2O2为建立模型的最适剂量，结果显示加入不同浓度的LNYPPY能够显著改善由H2O2诱导的VSMCs活性降低的现象（图4D、E）。该结果进一步说明抗氧化肽LNYPPY对H2O2诱导的VSMCs氧化应激损伤具有很好的保护作用。

结 论

本研究利用超滤、Sephadex G-75凝交柱分离层析、Sephadex C-25阳离子交换层析和Sephadex G-25凝交柱层析以及PeptideRanker数据库活性预测技术从WGAH中分离筛选得到了具有较高抗氧化活性的肽LNYPPY，并进一步通过高糖诱导VSMCs以及H2O2诱导HepG2细胞和VSMCs建立细胞氧化应激模型，发现LNYPPY对高糖诱导的VSMCs氧化应激损伤无明显改善作用，但对H2O2诱导的HepG2细胞和VSMCs氧化应激损伤具有很好的保护作用，且根据这一结果推测LNYPPY的抗氧化作用可能是通过Nrf2/HO-1信号通路的介导。本研究可为麦胚蛋白抗氧化肽的理论研究与开发应用提供重要参考。

本文《麦胚清蛋白抗氧化肽的筛选及对细胞氧化损伤的保护作用》来源于《食品科学》2021年42卷17期10-18页，作者：张羽，汪芳，翁泽斌，包伊凡，宋海昭，沈新春。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200901-012。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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