如何进行CRISPR/Cas9介导的基因敲除的验证？

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近期关于CRISPR/Cas9系统做编码基因的KO（敲除）的验证方法问题，收到很多咨询。大体分成两个，分别是：是否可以通过用qPCR检测目的基因的mRNA来验证是否有敲除效果？以及是否可以直接用wb验证目的蛋白的表达量来验证是否有敲除效果？因此决定写一篇文章对这两个问题作细致解答。

我们先看看CRISPR/Cas9介导编码基因KO的原理，在Cas9剪切DNA，导致双链断裂（DSB）后，细胞利用非同源末端连接（NHEJ）进行修复。NHEJ修复会在DSB位点随机引入碱基的插入或者缺失（Indel）。如果这些Indel不是3的倍数就会导致后续的阅读框发生移码，这种移码往往会产生提前终止密码子（premature termination codon，PTC）,导致蛋白功能的丧失（提前翻译终止的多肽一般会被降解），从而达到KO效果。

因此，如果从这个角度来看的话，Cas9介导的KO影响的是蛋白的翻译过程，而对mRNA的表达丰度没有影响。所以，我们是否就可以回答说，无法用qPCR来检测目的基因的KO效果呢？然而，在实际实验过程中，我们确实能够检测到部分KO细胞株mRNA的表达发生明显下调，这又是什么原因呢？

实际上，mRNA的翻译过程作为细胞内最重要的生物学过程之一，是受到很多质量监测的（Quality Control，QC）。当mRNA的模板或者翻译复合物有缺陷时，或者新生的多肽在翻译延伸或者终止过程中阻止核糖体的前进或者脱离时，翻译过程的QC事件将被激活，从而促使暂停的翻译复合物解体，回收或者降解单独的mRNA、核糖体、多肽等。

在翻译过程的QC事件中，有两条QC通路可能会参与CRISPR/Cas9介导的KO的mRNA的降解。第一条也是最主要的一条通路是无意义介导的mRNA的降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD），当核糖体遇到PTC发生翻译提前终止时，一系列与NMD相关的蛋白，如Upf、Smg将结合到翻译复合物，随后将降解mRNA（图1）。

第二条通路是无终止密码子导致的mRNA降解（no-stop decay, NSD），在CRIPSR/Cas9 KO系统中，如果发生移码后，一直没有碰到终止密码子，核糖体将翻译到mRNA的3’末端，而这就会激活NSD，降解mRNA。

图1. NMD途径导致的mRNA降解

由于NMD是影响CRISPR/Cas9 KO的mRNA水平的主要通路，我们对其详细过程再作进一步说明。前面讲过，当核糖体遇到PTC时将激活NMD。这里引出一个问题，细胞是如何识别PTC和正常的翻译终止？关于这个问题，目前主流的假说是外显子连接复合物（exon junction complex，EJC）模型。

在pri-mRNA通过可变剪接生成成熟的mRNA时，mRNA上的上游外显子和下游外显子的连接部分会被剪接复合物引入EJC，在经历第一轮翻译过程后，这些EJC蛋白将被核糖体从mRNA上剥离下来。如果一个PTC位于最后一个外显子上游50nt以上，在第一轮翻译结束后，EJC将依然能够结合在mRNA上，EJC与一些翻译终止蛋白相互作用，启动NMD。

是否存在PTC就会激活NMD？NMD的效率受到哪些因素调节？2016年发表在Nature Genetic的一篇文章The rules and impact of nonsense-mediated mRNA decay in human cancers，基于对TCGA数据库中9769个肿瘤病人的mRNA 表达量和基因拷贝数的分析，总结了影响NMD效率的一些因素。

对比PTC位于最后一个外显子上游至少50nt和PTC位于最后一个外显子内两种情况，NMD的效率分别为84.7%和1.7%（图2）。

同时，在这篇文章中，研究者还发现，当PTC位于距离起始密码子200nt内时，相比于PTC位于距离起始密码子超过200nt，NMD的效率明显降低（35% Vs 93%），这种情况无法用EJC模型解释，作者猜测可能是位于PTC下游的的AUG引起的翻译重起始的影响。其他一些NMD效率的影响因素还包括，外显子长度和mRNA本身代谢速率等。

图2. PTC位置对于NMD效率的影响

结合前面提到的两篇文章，我们可以这样说，CRISPR/Cas9介导KO中，部分单克隆细胞的mRNA表达会明显下调，但是有相当部分细胞其mRNA表达无非常明显下降。

因此，回到最初的问题， 对于CRISPR/Cas9的介导的KO细胞，mRNA的下调是有效敲除的充分条件，而非必要条件，因此不可以用qPCR检测目的基因的mRNA来验证是否有敲除效果（不包含特殊设计引物情况）。

图3. 193株KO敲除细胞系蛋白及mRNA表达情况

进一步地，在图3中我们可以看到，虽然所有细胞都经基因组鉴定是KO细胞系，但是依然有相当部分的细胞，质谱仍然检测到了蛋白残留，且这种残留水平和mRNA残留无明显相关性。随后作者验证部分蛋白残留及其功能，并提出了以下蛋白残留的猜想（图4）。

首先，如果蛋白在翻译阶段跳过被编辑的外显子，且不导致移码（in-frame skipping），这将造成相对较高的蛋白残留和功能保留。

其次，如果在翻译阶段未跳过被编辑的外显子，又触发了NMD过程，将导致蛋白几乎完全敲除。再次，如果在翻译阶段未跳过被编辑的外显子，却又未触发NMD，那就要看细胞是否发生翻译重起始，如果发生了翻译重起始，那么目的基因C端截断的蛋白将能够少量表达，这也可以一定程度上弥补该蛋白敲除导致的功能丧失。

综上，如果蛋白分子量较大，其基因组在发生移码后，翻译过程中有发生in-frame skipping translation，且被跳过的外显子较小，就会导致残留蛋白在分子量上和野生型蛋白没有明显差异（翻译重起始也有这种可能性）。

图4. KO细胞株蛋白残留解释假说

最后我们再将今天开始提的两个重点问题做一个总结。第一，对于CRISPR/Cas9的介导KO的细胞，不可以用qPCR检测目的基因的mRNA来验证是否有敲除效果；第二，KO混合克隆细胞，wb敲低是发生基因编辑的充分条件而非必要条件，因此同样不建议在未确定基因组是否发生编辑之前用wb的方式进行验证。

正是因为qPCR和wb验证的缺陷性，从Ca9 KO的最基本原理出发，现在文章验证是否发生基因组编辑的最常规方法包括测序和错配酶检测试剂盒验证（吉凯基因网上商城提供该产品和具体实验方法）。

其实，通过对今天第一和第二个问题的了解，对于我们挑选KO单克隆株也有一些启发。首先，我们知道了当PTC位于最后一个外显子上游50nt以上和起始密码子下游200nt以上时，其NMD的效率最高，所以为了更高的敲减效率，单克隆可以考虑从符合上述规则的克隆中选取（这样选择克隆会发生NMD的可能性会更高，并不是例如PTC位于起始密码子下游200nt内其NMD一定低于200nt以外的PTC）。

其次，为了尽量避免翻译重起始的影响，我们在选取单克隆时，可以尽量选择PTC下游没有in-frame AUG，或者in-frame AUG尽量靠近终止密码子的克隆。

最后，在设计sgRNA靶点时，可以尽量考虑设计在碱基数非3倍数外显子上面，以避免in-frame skipping translation的发生，但是由于KO sgRNA靶点设计往往限制因素很多，这一点的实现难度很高。