Science | 一种寡核苷酸合成的P (V)平台

撰文 | Gladiator

核苷酸由三部分组成，即含氮碱基、包含5个碳原子的糖分子 （这两部分为核苷） 和一个或多个磷酸基团。寡核苷酸是连接在一起形成单链生物聚合物很短的单链或双链核酸片段。由于寡核苷酸独特的基因表达调控优势，近年来，寡核苷酸药物的研发、生产和商业化也得到了快速的发展，在研药物分子的项目在不断增加【1, 2】。目前已有超过155个临床试验和多个美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的治疗性寡核苷酸，其中大多数含有修饰过的磷酸键【3】。尽管有许多方法学上的改良和提升，但目前寡核苷酸几乎都是使用化学方法合成，即采用固相亚磷酰胺三酯法合成，并用高效液相色谱分离纯化。各种磷酸键与寡核苷酸的结合已会对其产生的结构的性质和功效产生深刻的影响。然而目前，硫代反义寡核苷酸 (PS-ASOs) 的商业化面临着重大挑战。

近日，小分子药物发现团队Phil S. Baran在Science上发表题为A P(V) platform for oligonucleotide synthesis的文章。研究人员报道了一种灵活有效的基于[P（V）]的平台，可以随意将多种磷酸盐键组装到寡核苷酸中。该方法使用易于获得的试剂，不仅可以将立体定义的或外消旋的硫代磷酸盐，而且可以将（S、R或rac）–PS与天然磷酸二酯（PO2）和二硫代磷酸酯（PS2）键的任何组合组装到DNA和其他改性核苷酸聚合物中。该平台使用可持续制备的、稳定的P（V）试剂，在标准化耦合协议下轻松实现这种多样性。

该研究团队之前展示了一种实用的方法来解决立体硫代磷酸酯 (R-PS和S-PS，主要在DNA的背景下) 的合成，并披露了磷硫掺入 (称为PSI或Ψ) 试剂。然而，这项初步研究并没有解决与其他，如二硫代磷酸和天然磷酸二酯，其他糖化学 [如锁定核酸(LNA)] 的连接问题，或对现代自动合成协议的适用性。此外，基于P（V）的方法也存在一些固有缺陷，如合成速率缓慢、因鸟嘌呤和胸腺嘧啶碱基干扰顺序偶联导致的化学选择性难题等。因此，在这项研究中，研究人员设计了一项包含三种新的试剂体系 （Ψ2，rac-Ψ和Ψ0） ，提供了一种统一的P(V)方法，完全不同于基于P(III)的寡核苷酸合成，并能够随意和受控地合成特定的嵌合寡核苷酸（图1C）。这个氧化还原中性的平台以天然P(V)氧化态为基础，挑战以往反应迟缓的假设并允许一个寡核苷酸内访问五个相关的一系列糖骨架的P键 （DNAandLNA） 和碱基 （A,T,G，和mC） 。此外，该方法还消除了不稳定的氰乙基，从而消除了解除保护后丙烯腈的产生等。更值得一提的是，这种新的P(V)平台还省去了标准固相寡核苷酸合成 (SPOS) 协议中的一个完整步骤 （即磷氧化） 。

图1 寡核苷酸合成的P (V)平台的背景及设计

用于二硫代磷酸和天然磷酸二酯键的结合的Ψ2和Ψ0难度较大，相对而言合成rac-Ψ相对容易。Phil S. Baran研究团队在总结前人研究的基础上，避免了不安全的P(III)化学反应，并开发了一种稳定可行的P(V)试剂。目前还没有已知的P(V)基试剂能够实现P(III)竞争性反应和化学选择性，且稳定且易于自动合成。研究人员评估了30多种不同的主链以探讨环的大小，取代基，电子效应和立体化学来探讨对负载，耦合和整体稳定性的影响，发现Ψ0为唯一的候选物。具体的合成步骤如图2所示，并进一步与最先进的P(III)化学进行了比较，Ψ2二聚体通过P(V)加合物分两步得到，纯度为99%，并避免了硫的损失。另外，长期以来人们认为它们的偶联率降低，使其无法用于传统的自动化寡核苷酸合成体系。因此本研究使用动力学研究来评估它们与规范P(III)化学的耦合性能(图2C)。研究结果发现，尽管与文献一致，基于P(V)的磷酸三酯方法非常缓慢(图2C，橙色条)。然而，本文详细介绍的P(V)试剂组与行业标准P(III)方案表现一样好，所有反应在两分钟内达到完全转换。

在过去30多年的时间里，对磷酰胺基合成的SPOS方法进行了广泛的优化。尽管这些方法中的一些可以在新的环境中利用，但在某些领域，现有的解决方案与P(V)合成协议不兼容(图3A)。现有的通用载体对1,8-diazabicyclo [5.4.0]undec-7-ene (DBU)的稳定性不够，本研究中开发了一种通用载体，大大提高了碱基的稳定性。在前边成功的基础上，研究人员进一步将PO 2 加入这一结构，并发现这些嵌合序列可以在高纯度中获得，在合成过程中没有大量的硫损失。接下来，制备了具有PS和PS 2 连接的序列。最后，包含所有四种可能连接的结构被干净地生产出来。目前生产PS寡核苷酸的方法根据使用的特定条件会产生统计上的混合异构体。本研究最后通过将rac-Ψ装载到DNA核心上，获得了纯度较高的单体。

图2 一个用于寡核苷酸合成的全P(V)平台的开发，包含试剂研发等过程

综上所述，截至2020年1月，10种寡核苷酸药物已获FDA批准。然而目前关于其核酸修饰非常有限，且存在巨大空间。本研究作为寡核苷酸这一领域的新研究为未来的应用提供了令人信服的理由，因为其有助于获得医学上所需的嵌合序列，并提供了将其商业化的前景。

参考文献

1. Hughes JP, Rees S, Kalindjian SB, Philpott KL. Principles of early drug discovery.Br J Pharmacol.2011 Mar;162(6):1239-49. doi: 10.1111/j.1476-5381.2010.01127.x. PMID: 21091654; PMCID: PMC3058157.

2. Liu ZK, Yang LX, Wu SC, Shekhar C, Jiang J, Yang HF, Zhang Y, Mo SK, Hussain Z, Yan B, Felser C, Chen YL. Observation of unusual topological surface states in half-Heusler compounds LnPtBi (Ln=Lu, Y).Nat Commun. 2016 Sep 27;7:12924. doi: 10.1038/ncomms12924. PMID: 27671444; PMCID: PMC5052656.

3. Wilk A, Stec WJ. Analysis of oligo(deoxynucleoside phosphorothioate)s and their diastereomeric composition.Nucleic Acids Res.1995 Feb 11;23(3):530-4. doi: 10.1093/nar/23.3.530. PMID: 7885850; PMCID: PMC306707.

4. Knouse KW, deGruyter JN, Schmidt MA, Zheng B, Vantourout JC, Kingston C, Mercer SE, Mcdonald IM, Olson RE, Zhu Y, Hang C, Zhu J, Yuan C, Wang Q, Park P, Eastgate MD, Baran PS. Unlocking P(V): Reagents for chiral phosphorothioate synthesis.Science. 2018 Sep 21;361(6408):1234-1238. doi: 10.1126/science.aau3369. Epub 2018 Aug 2. PMID: 30072577; PMCID: PMC6349427.

5. Yang X. Solid-Phase Synthesis of RNA Analogs Containing Phosphorodithioate Linkages.Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2017 Sep 18;70:4.77.1-4.77.13. doi: 10.1002/cpnc.40. PMID: 28921494; PMCID: PMC5657504.

原文链接：

https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/science.abi9727