《食品科学》：板栗壳黄酮结构分析及其对胰脂肪酶活力的抑制作用

肥胖和超重会引发各种慢性疾病，其中最常见的慢性疾病包括高血压、心血管疾病以及糖尿病，严重影响人体的健康。胰脂肪酶（PL）作为人体肠道内的关键酶，可催化食物中摄入的大部分脂肪水解成甘油和脂肪酸，利用胰脂肪酶抑制剂抑制其活力可有效减少人体对脂肪的吸收，达到控制和预防肥胖及超重引发慢性疾病的目的。

研究表明，板栗壳中含有大量的黄酮类化合物，其降脂减肥的机理鲜见报道。武汉工程大学环境生态与生物工程学院的黄雪薇、雷嗣超、杨 芳*等人以野生板栗壳为原料，提取板栗壳黄酮，并结合超高效液相色谱（UPLC）-四极杆/静电场轨道阱质谱（Q-Orbitrap MS）对提取得到的板栗壳黄酮进行结构鉴定和组成分析，并且研究其在不同条件下对胰脂肪酶活力的影响及其对胰脂肪酶的抑制特性，为进一步将板栗壳黄酮开发为预防和抑制肥胖的功能因子提供理论依据。

1、板栗壳黄酮的提取得率和含量

采用醇提法，将提取得到的样品经AB-8树脂纯化得到板栗壳黄酮提取物，经计算，板栗壳黄酮提取得率为（5.66±0.05）%，其含量为（107.50±1.00）mg/g。可用于后续结构分析及胰脂肪酶抑制活性研究。

2、板栗壳黄酮结构分析结果

板栗壳黄酮总离子流图如图1所示。结合高分辨质谱信息和相关研究结果，本研究共鉴定出9 种酚类化合物，其中8 种属于黄酮类化合物，具体分析如下。

由图1、表1可知，当保留时间为17.7、26.8 min时，1、7号峰分子离子峰m/z 577，可确定化合物1、7的相对分子质量为678，二级质谱峰为m/z 425、289、451、407。B型原花青素二聚体是2 个原花青素单体通过C4—C8或C4—C6相连并在C2和C7或者C2和C5之间形成C—O—C键的化合物，在ESI-模式下失去一个氢原子得到m/z 578，以m/z 578为母体离子进行碰撞诱导分离，主要的裂解碎片离子为m/z 289、407、425、451，可鉴定该物质为B型原花青素二聚体。

3、不同反应条件下板栗壳黄酮对胰脂肪酶活力的影响

不同质量浓度的板栗壳黄酮对胰脂肪酶活力抑制率的影响

由图2可知，在0～0.062 5 mg/mL范围内，板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制效果明显弱于阳性对照奥利司他对胰脂肪酶的抑制效果，而在较高质量浓度0.062 5～0.125 mg/mL范围内，板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制效果逐渐接近奥利司他对胰脂肪酶的抑制效果，当板栗壳黄酮质量浓度高于0.062 5 mg/mL时，抑制效果趋于平缓，说明在此质量浓度时，板栗壳黄酮与胰脂肪酶的结合达到饱和。

不同pH值下板栗壳黄酮对胰脂肪酶活力的抑制作用

由图3A可知，胰脂肪酶的最适pH值在7.4，这是因为胰脂肪酶的等电点为5.0，在PNPP、磷酸缓冲液、N,N-二甲基甲酰胺及Triton X-100形成的pH 7.4的体系中的油-水界面发生反应时带负电荷，与Triton X-100带负电的羟基形成的亲水端发生互斥作用，更易与底物接触发挥更大活性。加入板栗壳黄酮后胰脂肪酶的最适pH值向碱性条件发生偏移，变更为7.7，初步推断板栗壳黄酮的加入使胰脂肪酶活性部位的基团离子化发生变化，因而产生最适pH值的微小偏移；在pH 7.4时，空白组与样品组的酶活力有显著性差异（P＜0.05）。由图3B可知，板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制率最大，为62.23%，与人体小肠部位的pH值（约6.8）相近，说明板栗壳黄酮在小肠部位能对胰脂肪酶发挥较理想的抑制效果。

不同反应温度下板栗壳黄酮对胰脂肪酶活力的抑制作用

由图4可知，未加抑制剂时，胰脂肪酶活力在30～37 ℃温度范围内呈现逐渐升高的状态，到达临界温度37 ℃时，胰脂肪酶活力达到最高，随即在37～43 ℃胰脂肪酶活力逐渐降低，因此判断胰脂肪酶的最适反应温度为37 ℃，这与人体内温度一致。人体内大多数酶的最适反应温度在35～40 ℃，如果继续升高温度可能破坏了胰脂肪酶的共价键结构使其结构发生改变失去活性；而加入板栗壳黄酮，胰脂肪酶活力在30～43 ℃温度范围内差异较小，最大差异为0.003 U/g，胰脂肪酶的最适反应温度发生改变，在高于37 ℃时更耐受，说明板栗壳黄酮的加入影响了胰脂肪酶的空间构象，改变了胰脂肪酶的热稳定性。

不同反应时间下板栗壳黄酮对胰脂肪酶活力的抑制作用

不同反应时间下板栗壳黄酮对胰脂肪酶活力的抑制作用结果如图5所示，在10～20 min时，胰脂肪酶活力随着时间的延长迅速增加，在20 min之后活力变化较不明显，呈现略微下降趋势，随着时间延长，PNP的生成趋于稳定；加入板栗壳黄酮，胰脂肪酶活力在20 min时最大，为0.022 U/g，而20 min之后的抑制效果强于20 min之前，证明随着时间的延长，板栗壳黄酮与胰脂肪酶的结合逐渐增强。反应时间大于20 min时，样品组的酶活力显著低于对照组（P＜0.05），表明板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制效果随时间延长而增强。

4、板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制作用类型

如图6所示，以1/[S]和1/V进行双倒数作图，当底物物质的量浓度为0.93～3.73 mmol/L时，改变抑制剂的浓度，直线的斜率发生改变，在x轴上的截距不变，即加入抑制剂，最大反应速率（V max ）降低，米氏常数（K m ）不变，这是非竞争性抑制作用的特性，由此可以看出，板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制作用类型为非竞争性抑制，根据图6计算可得抑制常数（K i ）为53.19 mg/mL，0 mg/mL板栗壳黄酮的V max 为5.19 μmol/（L·min），0.5 mg/mL板栗壳黄酮的V max 为3.55 μmol/（L·min），1 mg/mL板栗壳黄酮的V max 为2.03 μmol/（L·min）。

结论

用醇提法提取板栗壳黄酮，提取物经AB-8大孔树脂纯化，得到的黄酮含量为（107.50±1.00）mg/g，提取得率为（5.66±0.05）%。通过UPLC-Q-Orbitrap MS对提取得到的板栗壳黄酮进行结构分析，鉴定出9 种酚类化合物，分别为B型原花青素二聚体、B型儿茶素三聚体、儿茶素/表儿茶素、三没食子酰葡萄糖、A型原花青素二聚体、A型原花青素三聚体、异槲皮苷、甲基鞣花酸己糖及芦丁，其中8 种为黄酮类化合物。板栗壳黄酮对胰脂肪酶具有较好的抑制作用，IC 50 为0.074 mg/mL，在37 ℃、pH 7.4条件下具有较好抑制效果（抑制率为65.20%），证明板栗壳黄酮在小肠部位能对胰脂肪酶发挥较理想的抑制作用。板栗壳黄酮改变胰脂肪酶活性部位的基团，使其最适pH值向碱性偏移。用Lineweaver-Burk双倒数作图法证明板栗壳黄酮对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制，即板栗壳黄酮是与胰脂肪酶活性中心外的必需基团产生结合，与底物之间不存在竞争关系。胰脂肪酶是肠道内脂肪水解过程中的关键酶，抑制胰脂肪酶活力可减少食物中摄入脂肪的水解和吸收，降低肥胖和超重引发各种慢性病的风险。

本文《板栗壳黄酮结构分析及其对胰脂肪酶活力的抑制作用》来源于《食品科学》2021年42卷21期111-118页，作者：黄雪薇，雷嗣超，涂芬，谢辰阳，李杰，杨芳。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201126-275。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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