撰文：刘芳
编审：HS
排版：李雪薇
用一张芯片把你的皮肤组织瞬间变成血管或神经细胞，这听起来实在是太过科幻。然而印第安纳大学和俄亥俄大学的研究人员不但将其成了现实，还将芯片的制作技术全部开源。也就是说如果你掌握所需的医学知识，在五到六天之内就能按照说明书制造出一款自己中意的 VIP 组织转换芯片！
在这篇刊登于 Nature Protocols，名为 Fabrication and use of silicon hollow-needle arrays to achieve tissue nanotransfection in mouse tissue in vivo 的论文中，印第安纳大学的科学家们详细阐述了这种非侵入式且对人体无害的黑科技。利用电穿孔技术，你可以在毫秒内将质粒 DNA 直接导入到小鼠（或自己）皮肤的特定深度，将皮肤转染为血管或神经细胞。
nanotransfection 示意图 | 来源：印第安纳大学
作者称，这种“组织纳米转染技术”（tissue nanotransfection, TNT）所需要的设备是可以标准化批量生产的。“组织纳米转染技术”的最大优点是不需要用病毒作为载体，从而最大限度地降低了炎症反应和细胞死亡的风险。
发明这项技术的印第安纳再生医学和工程中心（Indiana Center For Regenerative Medicine And Engineering）主任 Chanda Sen 表示：“这篇论文将让更多人一同参与到再生医学中来。”
制备空心微针阵列
根据“纳米转染”说明书，改变组织功能共分为三个步骤（共 25 个具体操作环节）：制备空心微针阵列、制备 TNT 器件，以及对细胞进行转染。首先要考虑的是使用哪种微针阵列，各种不同形态的微针总有一款适合您。对于在局部皮肤导入质粒 DNA，作者建议使用尖端扁平的微针（见图 1A）。对于深层组织的导入，作者建议使用尖端锋利的微针以促进组织穿透( 见图 1B 或 1C)。
各种微针 | 来源：论文
选好款式以后我们就要进行手工制作了。
首先需要在双面抛光的 4 英寸硅（Si100）晶片上覆盖一层光刻胶，然后使用博世（Bosch）工艺对晶片进行深反应离子刻蚀（DRIE）。根据转染需要可以制备三种不同的硅空心微针，包括顶端扁平的一型（图 1E，Type I），顶端突出的二型（Type II）或带有偏心孔的三型（Type III）（图 1F，g)。后两种尖端锋利的微针阵列更有助于穿透到组织当中。
如果将针头的纳米通道直径缩小，那么针头输出生物分子的速度也将相应增加；但是相应来说，这也可能限制通过针头的分子总量。在纳米通道直径过小（<5 µm）的微针中通常可以观察到分子堵塞现象。这个问题可以通过优化孔径和使用偏心孔结构（Type III）来解决。通过使用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）形成氧化物涂层，可以将纳米通道直径调整到目标值。
此外，研究人员在在每个硅芯片上都连接了一个 Transwell，作为质粒 DNA 的储存库。
论文强调，要想做出高质量的微针阵列，必须特别注意两个方面。第一个是在翻转芯片以制造微针的纳米通道时需要精确对准（步骤 1A（Xix）），第二个是在制作的过程中要温柔，以避免针孔中出现堵塞的现象（步骤 1A（xxii，xxvii 和 xxiv））。
TNT 器件的制备
在芯片制作好之后，需要将其和电穿孔设备进行整合以实现质粒 DNA 的导入。首先 TNT 芯片上安装有一个储液器，用来储存有质粒 DNA 的溶液。为了实现纳米电穿孔，还需要一种精确控制的电脉冲发生器。研究人员用 PDMS 和固化剂混合，形成可嵌入芯片的 PDMS 薄膜。之后，芯片的正面、底面和 PDMS 膜的底面都用等粒子清洗机处理过，然后轻轻地压在一起，在各层之间形成完整的粘合。PDMS 膜的厚度应调整为 2-4 毫米。
论文表示，大于 4 毫米的 PDMS 膜不够灵活，不足以在芯片之间提供完全的防泄漏连接，而且还可能在连接过程中损坏芯片。而小于 2 毫米的 PDMS 膜又太柔软，因此在芯片和薄膜之间会产生褶皱和气隙。
小鼠实验 | 来源：论文
使用 TNT 器件进行体内转染
当利用电穿孔技术将 DNA 导入到体内时，所施加的电压决定了 DNA 分子上的迁移力有多大，从而决定了在恒定脉冲下导入的距离有多远。同时，电压还决定了电穿孔过程中细胞膜上的孔密度和平均孔径。中等电压（100-150 V/mm）可以平衡导入距离和孔隙参数。过高的电压会破坏细胞和组织结构。在实验中，研究人员使用了 8 到 12 周大的雄性小鼠。不过这并不代表活体小鼠实验局限于任何性别或年龄，任何小鼠都可以参与 。
为了便于 TNT 芯片能接触到皮肤更深层的细胞组织，实验中的小鼠都被脱毛。之后电脉冲通过装有质粒溶液的储液器和微针达到皮肤。该电脉冲为方波，参数可调。以 200 V 电压开始，穿孔脉冲电压可以不断增加以促进细胞膜孔隙的形成，之后再以 200 V 的驱动脉冲将质粒导入组织。较高的电压（>250 V）会增加驱动力，并在细胞膜上产生更大的孔隙，这有助于质粒的传递。但如果电压太大的话就会对细胞产生毒性。
作者表示，这款带有硅空心微针阵列的 TNT 芯片的最终目标是对组织进行重新编程。在这款芯片的帮助下，实验小鼠避免了后肢的组织坏死，甚至移植到大脑的神经细胞还改善了中风小鼠的神经功能。
目前，科学家们还没有在人类身上进行大规模的临床试验。但在制备纳米芯片的方法开源以后，想必会引来大批生物骇客的兴趣。
届时又会有怎样神奇的发现，我们拭目以待。
参考文献：
https://www.nature.com/articles/s41596-021-00631-0
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