FSHW | 芦荟苷通过JNK-IRS1/PI3K通路及调节肠道菌群发挥抗糖尿病作用

Introduction

碳水化合物代谢紊乱一直是2型糖尿病（T2DM）在世界范围内发病的主要原因。据国际糖尿病联合会估计，到2045年将有超过7亿人患有T2DM，其中许多病例发生在发展中国家，尤其是亚洲。目前现存的一些治疗药物，可用于控制这种糖尿病状况。例如，磺酰脲类和二甲双胍已被用作抗糖尿病药物来调节升高的血糖水平。然而，长期给药可在老年患者中引起二甲双胍的胃肠道不耐受或代谢性酸中毒、磺脲类药物引起的低血糖等不良反应。因此，发现和开发治疗T2DM的副作用更少的新型天然成分是目前急需解决的问题。

肠道微生物在机体动态生态系统中发挥着至关重要的作用，它的组成受到多种因素的影响，如内外环境。多重证据表明，糖尿病患者的肠道菌群中能够产生短链脂肪酸的潜在病原体和细菌。肠道微生物的这些变化可能导致血糖水平的升高。因此，调节肠道微生物被认为是预防或逆转T2DM的一个重要手段。肝脏和骨骼肌可以调节葡萄糖稳态，肝脏在改变血液中葡萄糖水平和葡萄糖储存发挥着主要作用。PI3K/AKT被认为是胰岛素信号转导中的关键通路。在胰岛素刺激下，胰岛素受体底物（IRS）酪氨酸发生磷酸化。而IR发展的关键机制就是抑制PI3K/AKT信号通路的激活。除此之外C-Jun N末端激酶（JNKs）可以调节正常转导胰岛素信号传导。

芦荟苷是芦荟中的一种主要化合物，其多种药理特性已经得到认可，包括抗炎、抗病毒、降血糖、抗氧化活性。然而，芦荟苷对2型糖尿病和肠道微生物的影响，以及影响IRS1/PI3K/AKT信号通路的因素仍有待研究和阐明。

福建农林大学食品科学学院的Ruting Zhong、Sumei Li*和Chao Zhao*等以2型糖尿病小鼠模型为研究对象，通过用低剂量链脲佐菌素（STZ）喂养小鼠高脂肪高糖饮食（HFSD）成功地生成了2型糖尿病（T2D）小鼠模型。同时体外研究了芦荟苷在IR-HepG2细胞中的潜在抗糖尿病活性，并分别在体内研究了其对T2D小鼠肠道微生物群和相关信号通路的影响。

Results and discussion

喂芦荟苷对HepG2细胞的毒性

通过MTT检测芦荟苷对细胞活力的潜在影响。结果表明，高达500 μg/mL的芦荟苷浓度不会损害细胞完整性，而浓度高于750 μg/mL会降低细胞活力（图1a）。

图1 细胞活力(a)；芦荟苷对HepG2细胞葡萄糖消耗影响(b)；芦荟苷对HepG2细胞中HK和PDH活性的影响（c）

芦荟苷对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

如图1 b所示，DEX显著抑制葡萄糖消耗，而用10-200 μg/mL的芦荟苷处理可以以剂量依赖性方式显著增加IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗。100和200 μg/mL剂量的芦荟素对IR的影响可与1.5 μmol/L浓度的二甲双胍相媲美，表明芦荟苷具有潜在的降血糖作用。

芦荟苷增加IR-HepG2细胞中HK和PDH的活性

HK和PDH是糖酵解的关键限速酶。50和100 μg/mL的芦荟苷显著增加了HK和PDH的活性（ P < 0.05，图1c）。HK 增加肝糖原含量和葡萄糖利用以产生能量。T2DM的治疗伴随着肝脏丙酮酸脱氢酶复合物活性的增加。作为丙酮酸脱氢酶复合物的第一种酶的PDH的活化可以减轻胰岛素抵抗。

芦荟苷对T2D小鼠体质量和FBG水平的影响

在治疗的第0、14和25天测量体质量的变化（图2a）。模型组、二甲双胍组和芦荟苷组中T2D小鼠的体质量显著低于正常组小鼠。与非糖尿病对照组相比，糖尿病小鼠体质量减轻。二甲双胍治疗组在给药14天后体质量减轻，然后保持稳定。此外，芦荟苷组糖尿病小鼠的体质量略有下降。FBG水平是检测糖尿病最广泛使用的测试，它反映了基础胰岛素分泌和胰岛β-细胞功能。图2b显示了芦荟苷处理对不同天数的T2D小鼠中FBG水平的影响。结果显示模型组肥胖小鼠FBG水平急剧升高，表明小鼠模型建立成功。治疗两周后，二甲双胍和芦荟苷治疗组的FBG水平与模型组相比均有下降（P < 0.05）。此外，芦荟苷组的FBG水平在第14天达到近11.1 mmol/L，与二甲双胍治疗组相当。

图2芦荟素对体质量(a)、FBG水平(b)、AUC(c)、FINS和HbA1c水平(d)以及EF指数(e)的体内影响

芦荟苷对T2D小鼠OGTT的影响

OGTT是糖尿病严重程度的重要指标。芦荟苷对T2D小鼠葡萄糖耐量的影响如图2c所示。模型组小鼠糖耐量严重受损，0 h时血糖水平明显高于其他组，30 min内迅速升高。模型组、二甲双胍组和芦荟苷治疗组葡萄糖的AUC分别为53.37、43.92和40.78，显著大于正常组的18.59（ P < 0.01）。但与模型组相比，芦荟苷治疗组和二甲双胍组的AUC显著降低（ P < 0.05）。这些结果表明，芦荟苷可以改善T2D小鼠的糖耐量受损。

芦荟苷对T2D小鼠FINS和HbA1c的影响

糖化血红蛋白（HbA1c）的百分比等于HbA1c浓度与总血红蛋白（Hb）的比率，用于准确验证阶段性糖尿病。STZ注射后，T2D模型小鼠FINS水平较正常小鼠显著降低（ P < 0.05）。在STZ诱导的T2D小鼠中，芦荟苷处理后，FINS水平显 著增加（ P < 0.05），这与正常组中观察到的效果相似（图2d）。ELISA结果显示，与正常组相比，模型组HbA1c水平显 著上调（ P < 0.01）。相比之下，在芦荟苷治疗组中观察到的HbA1c水平低于模型组。因此，芦荟苷可以在一定程度上改善血糖水平。

芦荟苷对T2D小鼠附睾脂肪指数的影响

本研究中评估了附睾脂肪（EF）指数（图 2e）。模型组降低，但二甲双胍和芦荟苷治疗有效提高。这一结果表明，芦荟素可以促进葡萄糖向脂质的转化，抑制胰岛素抵抗。

芦荟苷对T2D小鼠肝脏组织病理学的影响

如图3所示。来自正常小鼠的肝组织切片显示正常的组织学结构，没有细胞破裂，分布均匀，肝细胞完整（图 3a）。模型组中央静脉扩张、局部肝细胞坏死、炎性细胞聚集、充血等（图3b）。此外，T2D 小鼠肝组织切片的组织病理学染色比正常小鼠更深。在HFSD喂养的小鼠中观察到广泛的肝细胞空泡化，这表明脂肪在肝组织中积累。然而，芦荟苷和二甲双胍治疗显 著改善了糖尿病小鼠的这些组织病理学变化和炎症，导致肝脏结构相对正常（图 3c、3d）。

图3T2D小鼠肝脏的组织学分析（a）正常组，（b）模型组，（c）二甲双胍组，（d）芦荟苷组

微生物16srRNA基因的α多样性

为了确定不同类群特有的分类单元，使用Venn图对操作分类单元（OTU）进行聚类和划分，其中聚类达到97%的序列相似性。在所有组中总共识别出1 145 个OTU（图4）。此外，在正常组、模型组、二甲双胍组和芦荟苷组中分别观察到873、922、775和637 个OTU，其中模型组的肠道菌群丰度最高，芦荟苷组最低。此外，4 个小鼠组共有496 个OTU，正常、二甲双胍和芦荟苷治疗组共有105 个OTU。在正常组和模型组中分别观察到164和213 个独特的OTU（图4b），表明正常和T2D小鼠之间的微生物群存在差异。相比之下，二甲双胍组和芦荟苷组分别只有35 个和15 个OTU（图4a）。

图4正常（蓝色）、模型（绿色）、二甲双胍（红色）和芦荟苷（紫色）组中OTU分布的维恩图（a）。比较正常组和模型组（b）、正常组和二甲双胍组（c）、正常组和芦荟苷组（d）、二甲双胍组和芦荟苷组（e）之间的OTU

芦荟苷对T2D小鼠肠道菌群的影响

糖尿病等代谢紊乱与肠道微生物群的改变密切相关。芦荟苷能够通过降低升高的厚壁菌门/拟杆菌门比率来重塑STZ刺激的肠道微生物失衡。与此同时，芦荟苷处理后，GCA-900066575、毛螺菌科_UCG-006、厚壁菌门A2、普氏菌科UCG-001、拟杆菌属和拟杆菌门菌属的丰度显著增加。

图5芦荟苷对不同组T2D小鼠在门水平（a）和属水平（b）的肠道微生物群和丰度的影响;属级物种进化树样本的群落分布图（c）

芦荟苷对JNK/IRS1/PI3K/AKT信号通路的影响

进行western blot实验以评估芦荟通过JNK/IRS1/PI3K/AKT信号通路的降血糖作用。模型组JNK蛋白表达迅速增加，从而引发胰岛素抵抗（图6），而与模型组相比，芦荟苷组显著抑制JNK蛋白表达。同时，用芦荟苷处理后的IRS1/PI3K/AKT 蛋白表达明显升高。

图6芦荟苷对肝脏IRS1、PI3K、AKT和JNK表达的影响

Conclusion

本研究的结果证实了芦荟苷在IR-HepG2细胞和T2D小鼠中均具有降血糖活性。基于之前的报道，本研究确定了芦荟苷对肠道菌群和肝组织通过相关信号通路的降血糖作用。芦荟苷显著增加葡萄糖消耗并刺激IR-HepG2细胞中HK和PDH的酶活性。芦荟苷可以防止T2D小鼠体质量过度减轻，降低FBG水平，提高葡萄糖耐量。肝组织病理学显示芦荟苷具有肝保护作用。具体而言，芦荟苷改善肝脏胰岛素抵抗的分子机制可能归因于JNK的抑制和IRS1/PI3K/Akt信号通路的激活。此外，芦荟苷也可以通过增加类杆菌数量和减少厚壁菌、变形菌和放线菌数量来调节肠道微生物区系的丰度和多样性达到治疗作用。总而言之，芦荟素有潜力成为治疗糖代谢紊乱的辅助功能性食品。

Anti-diabetic effect of aloin via JNK-IRS1/PI3K pathways and regulation of gut microbiota

Ruting Zhonga, Lanbin Chena, Yuanyuan Liua, Shouxia Xieb, Sumei Lib,*, Bin Liua,c, Chao Zhaoa,c,*

a College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

b Department of Pharmacology, Shenzhen People's Hospital (The Second Clinical Medical College, Jinan University; The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology), Shenzhen 518020, Guangdong, China

c Engineering Research Centre of Fujian-Taiwan Special Marine Food Processing and Nutrition, Ministry of Education, Fuzhou 350002, China

*Corresponding author.

E-mail address: lism81@163.com; zhchao@live.cn

Abstract

This research aimed to investigate the antidiabetic activity, underlying mechanisms, and gut microbiota regulation of aloin. The insulin-resistant HepG2 (IR-HepG2) cell model and the type 2 diabetic (T2D) mouse model were successfully established using dexamethasone and a high-fat high-sucrose diet with low-dose streptozotocin, respectively. Aloin intervention increased glucose consumption and stimulated the activity of hexokinase and pyruvate dehydrogenase in IR-HepG2 cells. Additionally, it diminished the weight loss, reduced fasting blood glucose levels and hemoglobin A1c activity, and promoted glucose tolerance and fasting serum insulin activity in T2D mice. Histopathological analysis of the liver indicated hepatic protection by aloin. Additionally, aloin treatment inhibited the protein expression of c-Jun N-terminal kinases and activated that of IRS1/PI3K/Akt in the liver. Moreover, aloin modulated the bacterial community in the gut by raising the abundance of Bacteroidota and reducing the richness of Firmicutes, Proteobacteria, and Actinobacteriota. Thus, aloin ameliorated IR via activating IRS1/PI3K/Akt signaling pathway and regulating the gut microbiota, and it may be promising candidate as functional food for diabetic therapy.

Reference:

ZHONG R T, CHEN L B, LIU Y Y, et al. Anti-diabetic effect of aloin via JNK-IRS1/PI3K pathways and regulation of gut microbiota[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(1): 189-198. DOI:10.1016/j.fshw.2021.07.019.

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。