聚焦磷酸酶谁可率先打破诅咒，缔造神话|激酶谱筛选|靶点筛选

背景介绍

磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由羟基。在体内，蛋白质磷酸化的动态平衡是通过磷酸酶和负责蛋白质磷酸化的激酶来实现的。

图1. 磷酸化与去磷酸化调控机制

激酶-磷酸酶的平衡是机体维持正常生理学功能的基础，在细胞调节和信号传导中起着至关重要作用。磷酸化和去磷酸化通常是激活关键调控蛋白和控制信号通路传导的开关，一旦磷酸化过程发生异常，相关信号通路会出现功能性失调，从而促使多种疾病的发生，如癌症、炎症性疾病、糖尿病、传染病、心血管疾病以及神经退行性等疾病等。

磷酸酶分类

磷酸酶之间的结构差异性较大，并不像蛋白激酶一样具有相似的三维催化结构域。目前，大约有226种已知的蛋白磷酸酶，根据氨基酸底物不同，可分为3个家族：丝氨酸/苏氨酸（S/T）磷酸酶（PSPs）、酪氨酸磷酸酶（PTPs）和能够同时使S/T残基和酪氨酸残基（DUSP/MKP和PRL磷酸酶）或酪氨酸残基和脂质（PTEN）去磷酸化的双特异性磷酸酶（图2）。

PSPs可进一步分为三个亚家族：磷酸蛋白磷酸酶（PPP）、金属依赖性蛋白磷酸酶（PPMs）和天冬氨酸基磷酸酶，是磷酸酶中最具多样性的一大家族，如PP2A，它是由结构亚基A,催化亚基C和调节亚基B构成，A和C组成核心酶，在生物体内占PP2A的1/3左右，调节亚基由B55，B56，B72和STRN构成，在体内PP2A全酶种类可达75种（图2A）。

图2. 磷酸酶分类

PTPs可分为四个独立的家族，每个家族具有一系列底物特异性:I类PTPs包含38个 “经典”PTPs和61个类似VH1的“双特异性”蛋白磷酸酶（DSPs）; II类PTP是一种低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶 (LMPTP)，在进化过程中非常保守; III类PTP包含三种人类细胞周期调节因子CDC25A、CDC25B和CDC25C; Ⅳ类PTP仅包括四种Eya蛋白质（图3）。PTP家族最显著的特征之一是大多数酶由模块化结构域的组合组成，38个 “经典”PTPs包含21种受体型磷酸酶和17种非受体型磷酸酶（图4）。

图3. PTPS分类图4. PTPS结构

磷酸酶抑制剂研发历程

靶向PTP1B抑制剂

靶向磷酸酶药物的研制起步时间并不比激酶抑制剂晚，到目前为止，全球已有98种小分子激酶抑制剂被批准，其中FDA批准了71个，作用靶点分布于 21 个激酶家族，约占人类激酶组所有激酶家族的 20%，然而安全有效的磷酸酶抑制剂仍难觅踪影。人类对于磷酸酶抑制剂的研究可追溯至上个世纪八十年代后期，现任冷泉港实验室癌症中心副主任Nicholas Kester Tonks教授率先发现了PTP1B，它是一种非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，位于胞浆内质网，与蛋白络氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinase, PTK）共同维持着络氨酸蛋白磷酸化的平衡。随后的研究表明PTP1B是胰岛素信号转导通路中关键的负调节蛋白。

图5：ＰＴＰ１Ｂ在胰岛素和瘦素信号通路中的负调控作用

当胰岛素与其受体IR结合后，会使受体的多个Tyr残基及下游胰岛素受体底物(IRS1)磷酸化，进而激活PI3K-Akt信号通路，导致Ⅳ型葡萄糖转运蛋白（GLUT4）转移至细胞表面，促进葡萄糖的摄取。Akt也可通过抑制GSK3活性刺激糖原合成。PTP1B促使磷酸化的 IR和 IRS1脱去磷酸，进而终止IR信号，抑制细胞对葡萄糖的摄取，产生胰岛素抵抗。瘦素与瘦素受体（ObR）结合后使 JAK2及下游 STAT3磷酸化，磷酸化的 STAT3转移至细胞核，对控制脂质稳态、食物摄取以及能量消耗的相关靶基因转录进行调控，PTP1B使瘦素活化的 JAK2去磷酸化失活，从而抑制瘦素信号转导（图5）。这些研究表明PTP1B是治疗II型糖尿病和肥胖的潜在靶点，这使得各大医药公司争先恐后地开始以PTP1B作为靶点进行药物研发。然而这一个被人寄予厚望的明星靶点却使得各大医药公司折戟沉沙，赔得血本无归，三十多年的时间内没有一款PTPIB的抑制剂成功上市，这也使得磷酸酶家族背上了“不可成药”的名声。

细胞膜通透性差和选择性不佳是阻碍 PTP1B小分子抑制剂开发进程的主要原因。

PTP1B抑制剂主要靶向３个重要位点，即Ｎ端的两个芳基磷酸酯结合位点—亲和力高的催化位点（Ａ位点）和亲和力低的非催化位点（Ｂ位点），以及远离催化口袋的Ｃ端变构位点（Allosteric inhibitor binding site）(图6)。由于PTP1B活性位点口袋带正电，所以一般作用于活性位点的化合物都为带有电负性基团的pTyr模拟物或者是强极性化合物，而PTP1B又是分布在细胞膜内，带电或强极性的化合物无法通过细胞膜而聚集有效的药物浓度。其次，PTP1B与其他酪氨酸磷酸酶具有高度相似的催化结构域，如TC-PTP，其活性位点同源性高达94%。如何克服这些药物的选择性和透膜性成为当前PTP1B抑制剂研发进程中不可逾越的一道坎。

图6：PTP1B 晶体结构

近年来随着早期进入临床的药物相继失败或终止研究，以及考虑到PTP1B靶点本身的局限性，被报道的该靶点研究项目和进入临床的候选药物越来越少。不断的失败让很多人认为磷酸酶不适合作为药物开发的靶点，磷酸酶抑制剂也随之慢慢淡出了人们的视野。直到SHP2变构抑制剂的出现，才重新点燃了人们对于磷酸酶抑制剂研发的激情。

靶向SHP2抑制剂

SHP2（由PTPN11基因编码）在人体所有组织中广泛表达，是蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）家族的一员，在生长因子受体信号转导下游发挥重要作用。从结构上看，SHP2包含两个串联的SH2结构域（N-SH2和C-SH2）、一个PTP结构域和一个无序的C端尾部，该尾部具有两个酪氨酸磷酸化位点（Tyr542和Tyr580）。SHP2在基础状态下处于一种自抑制的封闭构象，其中N端SH2结构域与PTP结构域关联，由PTP结构域和N-SH2结构域之间的大量的非共价键来维持。当刺激性肽（如胰岛素受体底物[IRS]，受体酪氨酸激酶[RTKs]，成纤维细胞生长因子受体底物[FRS]，支架蛋白（Grb2相关的结合蛋白[Gabs]等）与SH2结构域结合时，N-SH2和PTP之间的自抑制作用被破坏，SHP2从无活性状态转化为活性状态（图7），从而形成可与含有pTyr残基相结合的催化口袋。C-SH2虽然不如N-SH2与PTP结合起决定性作用，但是也有助于SHP2的底物结合特异性和提高催化活性。

图7：SHP2结构

图8：癌细胞中SHP2调节的信号通路

SHP2是PTPs家族中唯一被验证的原癌蛋白，它正在成为一个令人关注的癌症靶点。SHP2位于多条受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路上的节点位置，几乎所有的 RTK均通过激活SHP2 来启动 RAS 信号通路，而激活RAS对癌细胞的生长和存活都非常重要。因此，一个合适的 SHP2 抑制剂可以应对不同型的 RTK 基因突变，具有成为广谱抗癌药物的潜力。SHP2与RTK磷酸化位点结合后激活RAS-ERK信号通路的机制包括：① Ras GAP在RTK上的脱磷；②招募Grb2/SOS复合体；③ Sprouty（一种RAS的负调节因子）的去磷酸化；④ CSK结合位点去磷酸化激活Src；⑤募集Gab1激活PI3K AKT mTOR信号通路。此外，SHP2被IL-6/IL-6R/gp130复合物招募，并与gp130的细胞质酪氨酸尾结合，以调节JAK-STAT3信号通路（图8）。由于SHP2与蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路的重叠，SHP2 抑制剂可以与激酶抑制剂联用从而对相互连接的信号通路进行双重抑制，这种组合疗法比单一疗法更有效，既不易产生耐药性，又能逆转 PTK 抑制剂的获得性耐药性。

图9：SHP2在T淋巴细胞中调节的信号通路

此外，SHP2还参与程序细胞死亡检查点PD-1/PD-L1的信号通路，调节T细胞的活性。SHP2介导的对多种信号通路的抑制共同阻止T细胞活化。T细胞中的许多免疫抑制受体，如PD-1、CLTA-4、BTLA、TIGIT等，可以通过其细胞质区域的各种基序招募SHP2。SHP2可通过以下信号途径发挥免疫抑制作用：①直接抑制下游PI3K-AKT信号通路；②ZAP70去磷酸化以间接抑制PI3K-AKT和RAS-ERK通路；③ T细胞的去磷酸化激活共受体CD28，间接抑制PI3K-AKT信号通路（图9）。鉴于当前抗PD-1/PD-L1肿瘤免疫疗法在临床上的成功应用，SHP2小分子抑制剂作为PD-1/PD-L1药物的重要补充，在肿瘤免疫治疗方面备受临床期待。因此，SHP2被认为是一个理想的癌症干预靶标，其抑制剂的开发已成为当前抗癌新药研究的热点。

SHP2抑制剂根据作用位点不同可分为两大类：作用于催化位点的抑制剂和作用于变构位点的抑制剂。早期SHP2抑制剂的研发主要集中在催化位点，NSC-87877是第1个被成功鉴定出能够抑制SHP2 PTP结构域的抑制剂(IC50=0.32μM)。但由于SHP2活性位点的高度保守、极性和带电环境, 使得靶向催化位点的抑制剂存在选择性低、透膜性差及生物利用度不足等缺点。经过十几年的研究和发展，SHP2催化位点抑制剂仍然没有达到理想的体内疗效。于是，研究人员将研究重点转向SHP2的变构模式，避开传统的磷酸酶催化域，提高了药物的口服生物利用度和透膜性，由此开启了SHP2抑制剂研究的新阶段。

图10：SHP099结构及作用位点

诺华（Novartis）是第一个成功靶向SHP2变构抑制剂的公司，2016年，该公司报道了化合物SHP099，它能结合到2个SH2结构域和PTP结构域三者之间，并将酶锁定在其封闭的非活性构象中而抑制SHP2活性（图10和11），这一独特的作用方式使SHP099成为首个高选择性的SHP2抑制剂，其发现为SHP2这一靶点的研究开启了希望之门。在之后的研究中，诺华对其进行了进一步的结构优化、提升理化性质、降低毒性并最终得到了化合物TNO155，这是全球首款进入临床阶段的SHP2别构抑制剂。诺华首先利用全长的SHP2酶筛选出抑制SHP2活性的小分子化合物，随后使用截短的SHP2蛋白排出靶向磷酸酶催化域的化合物，最后获得靶向非磷酸酶催化域的别构抑制剂。

图11：SHP099变构抑制剂作用原理

由于SHP2处于多种信号通路的交汇点，因此，SHP2 抑制剂从设计之初就进入了联合用药的范畴，以此来最大化发挥它的作用。2019年，诺华宣布与Mirati Therapeutics公司达成合作协议，将在临床试验中评估TNO155与MRTX849联用治疗携带KRAS G12C突变的晚期实体瘤的疗效；同年，诺华TNO155的临床试验申请在中国获批，将与LEE011（CDK4/6抑制剂）联合或者与PDR001（PD-1抑制剂）联合用于特定晚期恶性肿瘤的治疗；2020年7月，启动与dabrafenib、trametinib、spartalizumab、LTT-462和LXH-254联合治疗晚期或转移性BRAF V600结直肠癌的Ib期试验；2021年2月，诺华启动了TNO155联合JDQ-443和spartalizumab的Ib/II期试验。TNO155其他的联用方案包括与EGR816(第三代EGFR抑制剂)、loriatinib (第三代ALK抑制剂)治疗非小细胞肺癌等。

数据来源：Meet Novartis Management | November 2020

在诺华TNO155临床试验仅仅8个月后，全球第二款SHP2变构抑制剂JAB-3068便推进到了临床期。这是一款由北京加科思新药研发有限公司自主研发的原创新药，也是国内首款推进到临床期的SHP2变构抑制剂。随后，加科思凭借开发JAB-3068的经验，又设计了一款抗肿瘤活性更强的SHP2抑制剂JAB-3312。这两个项目均已获得美国FDA用于食道癌（包括食管鳞癌）的孤儿药认定。这两款抑制剂以同时与SHP2的三个结构域相互作用，将其锁定在封闭的非活性构象中，具备对SHP2的高效选择性，可以阻断RTK/RAS/MAPK信号通路，抑制RTK驱动或KRAS、BRAF Class 3、NF1 LOF突变的肿瘤细胞的生长和增殖；同时 JAB-3068和 JAB-3312可以阻断PD-1抑制信号增强CD8+T细胞杀伤功能，并通过抑制肿瘤相关巨噬细胞功能来解除肿瘤微环境中的免疫抑制，从而发挥抗肿瘤作用。

除了单药疗法外，加科思也在积极探索JAB-3068和JAB-3312与其他药物的联合用药。

如JAB-3312与自身研发管线中的KARS G12C抑制剂联合疗法针对KRAS G12C突变阳性的NSCLC、结直肠癌适应症研究正在全球1期试验中，这对于同时拥有SHP2抑制剂与KRAS G12C抑制剂的加科思来说，联合用药将具有无与伦比的优势。除此之外，加科思还在尝试JAB-3312与MEK抑制剂的联用治疗结直肠癌以及胰腺癌；JAB-3068和JAB-3312与PD1单抗联用治疗食道鳞状细胞癌，头颈部鳞状细胞癌,非小细胞肺癌等。

数据来源：加科思官网

在SHP2别构抑制剂领域，除了走在最前列的诺华和加科思之外，其他各大药企也在积极布局，如Revolution Medicines / 赛诺菲（Sanofi）共同研发的RMC-4630（I/II 期），Relay Therapeutics 公司开发的 RLY-1971（更名 RG6433，I 期），Pfizer研发的PF-07284892（I 期），Navire Pharma研发的BBP-398（I 期）等等。在国内除加科思外亦有一批创新药公司向这一领域发起挑战：如圣和药业自主研发的SHP-2小分子抑制剂SH3809已获批中美临床试验许可；奕拓医药自主研发具有全球知识产权的SHP-2变构抑制剂ET0038已获得FDA新药临床试验许可；诺诚健华自主研发的ICP-189于2021年底获得中美临床试验许可。

靶向其他磷酸酶抑制剂

除了PTP1B与SHP2抑制剂外，靶向其他磷酸酶的药物研究较少，只有IFB-088、PRL3-zumab、LB100等少数几款药物推进到了临床期（表1）。IFB-088是法国制药公司InFlectis BioScience研发的，目前处于临床试验I期，是一种PPP1R15A的别构抑制剂，用于治疗遗传性原发性运动感觉性神经病（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT）的1A、1B亚型。PRL3-zumab一款人源化单克隆抗体药物，由新加坡科技研究局（A*STAR）研发，作用于PRL-3（ phosphatase of regenerating liver，肝再生磷酸酶-3），用于治疗胃癌。LB-100由Lixte Biotechnology公司研发，直接作用于PP2A的催化亚基，目前已完成临床I期试验，对晚期肿瘤生长具有抑制作用，该药也可以用于治疗中风、2型糖尿病、心脏病及重度抑郁症。

表1：部分临床试验中的磷酸酶抑制剂

总结

作为“不可成药”靶点的磷酸酶，在早期研发的抑制剂均因选择性差、生物利用度低等原因未能成药，尽管业界在不断探索磷酸酶抑制剂的作用机制，并持续挖掘磷酸酶靶点药物的治疗潜力，但不能忽视的是，相比于激酶、PD1、KRAS等热门领域，磷酸酶的研究积累仍然有限，而且磷酸酶的作用机制更为复杂，针对磷酸酶靶点的药物开发还需要一段相对复杂的探索过程。

尽管近年来磷酸酶抑制剂的研究已取得重要进展，然而迄今为止，全球尚无磷酸酶抑制剂获批上市。已报道体内有效的选择性磷酸酶抑制剂仍处在早期临床研究中，如何减轻磷酸酶抑制剂对正常细胞的毒性作用，靶向抑制癌细胞的磷酸酶活性成为当前首要解决的问题。而磷酸酶新的别构位点及别构口袋的发现和药物设计，以及磷酸酶靶向降解剂的成药性研究仍将是未来需要持续解决的科学问题。随着科学技术的不断进步以及对磷酸酶研究的不断深入，我们有理由相信磷酸酶将成为下一个药物研发的热门领域，有望产生全新的重量级药物，谁将率先打破磷酸酶“不可成药”的诅咒，缔造下一个药物神话，让我们拭目以待！

结束语

爱思益普专注于基于靶点的先导化合物筛选和优化，批量构建了新药筛选的靶点和筛选技术，致力于以高效、专业的服务，帮助新药研发企业快速有效地推进新药研发项目。在磷酸酶领域目前已构建了包括SHP1、SHP2和PTP1B在内的磷酸酶平台，另外还有十数种磷酸酶靶点正在构建中，公司已具备了全面开发磷酸酶平台的能力。

数据来源：爱思益普

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