淋巴瘤的诊断难度较大，往往需要综合血液病理学（包括组织和细胞形态学、免疫表型、遗传学和分子生物学）与临床特征才能做出精确诊断，但流式细胞术（FCM）免疫分型作为与免疫组织化学相补的诊断方法，以其快速、客观、定量及多参数分析等独特优势，在淋巴瘤诊断方面也发挥着不可替代的作用。
为了帮助大家更好的了解流式检测技术在成熟T淋巴细胞肿瘤，尤其是在T/NK细胞淋巴瘤诊疗中的应用，高博流式创新研究院系列课程再次邀请上海交通大学医学院附属瑞金医院翁香琴教授，为我们分享《流式细胞术诊断成熟T淋巴细胞肿瘤》这一讲的精彩内容。
FCM在非霍奇金淋巴瘤（NHL）
诊断中的作用
FCM在NHL诊断中的作用主要分为三个方面：确定诊断、辅助诊断和微小残留病（MRD）检测。
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可以明确NHL诊断
主要见于具有特征表型并常以白血病形式存在的淋巴瘤类型，如急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤（ALL/LBL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、毛细胞白血病（HCL）、浆细胞肿瘤（PCN）、T大颗粒淋巴细胞白血病（T-LGLL）、NK细胞-慢性淋巴增殖性疾病（NK-CLPD）、成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）、肝脾T细胞淋巴瘤（HSTL）、Sezary综合征等。
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作为NHL辅助诊断
主要是指免疫表型不具有特异性，或具有特定遗传学异常的淋巴瘤类型，FCM可以作为形态学、遗传学的重要补充，起到辅助诊断的作用。
常见的有：边缘区淋巴瘤（MZL）、滤泡淋巴瘤（FL）、幼淋巴细胞白血病（PLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）、Burkitt淋巴瘤（BL）、非特指型外周T细胞淋巴瘤（PTCL，NOS）血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤（AITL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等。
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MRD监测
对于成熟淋巴细胞肿瘤来说，较为成熟的FCM-MRD检测方案主要集中在B细胞类型上，检测灵敏度可以达到10-4~10-5。
而T/NK细胞淋巴瘤的肿瘤细胞免疫表型与正常T/NK细胞重叠性较大，导致识别肿瘤细胞的灵敏度不高，FCM对T/NK细胞淋巴瘤的MRD检测尚不成熟。
二、成熟T细胞肿瘤
我们在分析成熟T细胞肿瘤异常免疫表型之前，首先需要了解正常成熟T细胞的免疫表型特点。
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正常成熟T细胞的免疫表型
T细胞占外周血淋巴细胞的60%～70%，在胸腺中分化发育，成熟过程中CD34、TdT、CD99和CD1a等抗原消失，出现T细胞受体（TCR）基因重排，并最终与膜CD3形成复合物。
αβ和γδ T细胞在胸腺发育早期出现分化，静息状态下，绝大多数（>95%）循环中的T细胞为TCRαβ型。γδT细胞主要分布在脾脏红髓、呼吸道和肠道的黏膜和皮下组织内。
正常外周血CD4/CD8比值约为2∶1，骨髓中则相反，约为1∶2，正常成熟T细胞表达CD2、CD3、CD5和CD7，表达CD4或CD8，在外周血中CD4、CD8双阳性和CD4、CD8双阴性细胞比例较低。
此外，正常成熟T细胞CD45RA/CD45RO呈现异质性表达模式。最重要的是，正常T细胞呈非克隆性增殖。
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成熟T细胞肿瘤的异常免疫表型
肿瘤细胞最大的特点克隆性增生，即丧失异质性，成熟T细胞肿瘤的异常免疫表型主要表现为以下几个方面：
① 抗原表达强度的改变：1个或以上的泛T细胞抗原表达强度改变，CD3、CD5、CD7表达异常较为常见，CD2则较少见；
② T细胞群体中某些抗原表达异常升高：如CD16、CD56、CD57、CD25、HLA-DR、CD279等；
③ 伴有异常抗原表达：如CD13、CD33、CD10、CD20、CD30、CD103等；
④ CD4/CD8比例失衡：大于10:1或小于1:10；病毒感染时可见CD4-CD8+T细胞的大量扩增，注意鉴别；
⑤ CD4+CD8+或CD4-CD8-细胞群比例升高；
⑥TCRα/β+细胞呈克隆性增生，TCR γ/δ+T淋巴细胞表达TCRV δ1为主。
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T细胞克隆性检测
① T细胞克隆性鉴定的价值
优点：敏感性较高，几乎所有肿瘤性T细胞都克隆性增生。
缺点：肿瘤特异性不如B/浆细胞中的κ、λ轻链；存在假阳性，某些反应性T细胞也可出现克隆性增殖；存在假阴性，大量正常T细胞中包含少量肿瘤细胞时易漏检（设门抗体的选择至关重要）。
② TCRα/β+细胞的克隆性鉴定
对于α/β+T细胞来说，克隆性鉴定的方法分为两类：
检测T细胞受体β链可变区（TCRvβ）的24种抗原表位。正常T细胞分散表达24种TCRvβ抗原，总和约70%。当出现其中1种TCRvβ抗原的显著增高或者24种表位总和的显著减低时，均提示T细胞的克隆性增生（图1-图4）。
检测T细胞受体β链恒定区抗原（ T cell receptor beta chain constant region，TRBC)。正常T细胞部分表达TRBC1，部分表达TRBC2，只表达TRBC1或TRBC2可提示T细胞的克隆性增生（图5-图6）。目前商品化有售的只有TRBC1，TRBC1阳性率大于85%或小于15%可作为克隆性证据。
翁教授指出，TRBC方法只需要检测两种抗原，比TCRvβ简便许多，但其鉴定T细胞克隆性的准确性与TRCVβ检测结果是否可比，还有待更多的数据验证。
图1 TCRvβ系列抗原检测——正常TCRα/β+细胞分散表达24种TCRvβ抗原
(Total TCRVβ 70.9%，符合正常T细胞的多克隆性增生)
图2 TCRvβ系列抗原检测——反应性TCRα/β+细胞
(Total TCRVβ 88.9%，其中TCRVβ7.1占30.6%，符合寡克隆性增生)
图3 TCRvβ系列抗原检测——TCRα/β+细胞克隆性增生
(TCRvβ13.1约占86.4％，提示T细胞呈克隆性增生)
图4 TCRvβ系列抗原检测——TCRα/β+细胞克隆性增生
(Total TCRVβ 5.4%，间接提示存在其它的TCRVβ克隆)
图5 TRBC系列抗原检测——反应性T细胞非克隆性增生
图6 TRBC系列抗原检测——TCRα/β+细胞克隆性增生
(TRBC1表达>85%或<15%，提示T细胞克隆性增生)
③ TCRγ/δ+细胞的克隆性鉴定
对TCRγ/δ+细胞的克隆性鉴定相对较难。正常成人γ/δ+T细胞表达TCRVδ2为主（胚胎期T细胞表达TCRV δ1为主），γ/δ+T细胞高表达TCRV δ1可提示克隆性。
三、成熟NK细胞肿瘤
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正常成熟NK细胞的免疫表型
正常NK细胞表达CD2和CD7，部分表达CD8，不表达sCD3、CD4和TCR，多数情况下不表达CD5（部分NK细胞亚群表达CD5），NK细胞特征性地表达CD16、CD56、CD94、CD161和颗粒酶B（granzyme B），或多或少表达CD57，均一性表达CD45RA，KIR系列抗原表达呈现多克隆性分布。
外周血中存在两个NK细胞亚群，绝大多数为CD56dimCD16＋NK细胞，杀伤活性较强，少数为CD56stCD16dim/－NK细胞，主要功能是分泌细胞因子。
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成熟NK细胞肿瘤的异常免疫表型
成熟NK细胞肿瘤的异常免疫表型可以表现为NK细胞标志物（CD16、CD56、CD57和CD94等）的异常表达，也可出现CD2和/或CD7表达减弱或缺失，少数病例可获得CD5的表达。
侵袭性NK细胞（图7）与EB病毒感染高度相关，白血病表型多为CD3－CD16－CD56st，而NK-CLPD的细胞（图8）表型为CD3－CD56dimCD16＋，表型更为成熟。
图7 侵袭性NK细胞白血病示例
（CD3-CD2+CD7-CD56stCD16dimCD94+CD57-CD45RA+CD45RO+，
FS/SS均大于正常NK细胞）
图8 NK-CLPD示例
（CD3-CD56dimCD16stCD94+CD57+CD45RA+CD45RO-，
FS/SS同正常NK细胞）
四、FCM检测在T/NK细胞淋巴瘤
诊断中的应用
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T/NK细胞淋巴瘤的FCM诊断流程（图9）
图9 常见T/NK细胞淋巴瘤的典型免疫表型鉴别诊断流程图
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T/NK细胞淋巴瘤免疫分型的抗体选择
为了尽可能地优化抗体和样本用量及对不同亚型淋巴瘤的精确诊断，临床检测中通常采用两步法：先应用一线抗体确定肿瘤属性和系别，随后应用二线抗体进行精准分型。
T/NK系一线初筛抗体包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD45和CD56。确定为肿瘤细胞及其系别来源以后，进行第二步全面精细检测。
二线抗体有：cCD3、CD10、CD16、 CD57、 CD25、CD26、CD30、CD45RA、CD45RO、TCRαβ、TCRγδ和cTIA-1等。
随后，翁教授结合病例讲述了成熟T细胞肿瘤数据的具体分析思路（图10~图17）。
图10 成熟T细胞肿瘤数据分析思路示例
图11 MF/SS示例
（CD3+CD7-，CD4+CD8-，CD26-，FS/SS较小，多数不表达NK相关标记）
图12 AITL示例
[CD3-CD4+CD8-CD5+CD2+CD7dim/-（最常见）]
图13 T-PLL示例
（CD3+CD4+CD8+，CD7stCD5st，CD52st，FS或略大，多数不表达NK标记。
T-PLL中约60%CD4+CD8-，25%CD4+CD8+；强表达CD52，表达cyTcl1）
图14 ALCL示例
（CD30+CD2+CD5-CD7-CD4-CD8-CD3-，FSC较大，“null phenotype”）
图15 TCRα/β+ T-LGL示例
（CD3+CD8-CD4-CD5dim/-CD57+CD16+, TCRγ/δ+, TCRVδ1+）
图16 HSTCL示例
（CD3+CD2+CD7+CD5- CD4-CD8- ，CD16+CD57+CD56-TCRγ/δ+，FS、SS较大）
图17 肝脾CD4-CD8-TCRαβ+ T细胞淋巴瘤示例
（骨髓中可见到免疫表型异常的T淋巴细胞：FSC小、SSC低，CD7表达缺失，CD3表达略下调，CD4-CD8-，CD5+CD2+且表达强度未见异常，TCRαβ+TCRγ/δ-，CD45RO+CD45RA-，CD16-CD56-CD94-，CD57p+，CD45st；TCRVb3约占98.0%，提示T淋巴细胞克隆性增生）
最后，翁教授对本课程进行了小结。翁教授再次强调了掌握正常NK/T细胞抗原表达规律是免疫分型诊断NK/T细胞淋巴瘤的前提。异常NK/T淋巴细胞常见的免疫表型为NK/T细胞抗原表达量的异常和克隆性增生。
此外，翁教授还特别指出克隆性NK/T淋巴细胞增生并不等同于肿瘤，需要结合临床和随访进行综合诊断。
参考文献
[1]王慧君,吴雨洁,翁香琴,徐卫,邱录贵.流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识[J].中华病理学杂志,2017,46(04):217-222.
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专家介绍
翁香琴
北京大学血液病研究所
上海交通大学医学院附属瑞金医院
遗传学专业，负责上海瑞金医院血液学研究所流式细胞技术平台。
主要研究方向：多参数流式细胞术在血液系统肿瘤诊断及MRD监测中的应用，并以第一作者身份发表相关SCI论文数篇。参与执笔撰写《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识》和《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微量残留病专家共识》。
编辑 | 赵薇
审核 |翁香琴
排版 | Cécilia
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