爱思益普|如何解读药物的致心律失常毒性？

药物致心律失常的毒性，是新药研发征途中主要的潜在风险。它投下巨大的阴影，让人们忧虑：它掏出的老拳，会击碎那些如精灵般迷人的化合物。这，真是一出悲剧。于是，我们用hERG架起坚固的铁门，看上去简单而有效，结果却带来其他的烦恼： 这座巨门也阻挡了诸多安全有效的化合物。那么，在研发早期，该如何去合理地评价心脏毒性呢？背负hERG阴影的化合物能否得到救赎呢？来，让我们一起从离子通道，动作电位的各个层面，试着去探索一下吧！！！

1. 离子通道

hERG是比较重要的衡量心脏毒性的标准，而且判断标准相对清晰。 学者做过总结： 20%+的 hERG 抑制率， 就可以在动作电位的 APD90 和心电图QT间隙上产生可以检测到的延长。 对于单纯的hERG抑制剂，尤其如此。 在动作电位的平台期，主要是Cav1.2的内向电流和IKr外向电流的协同作用（宏观体现为外向电流），当APD进入复极期时，主要就是钾离子通道的外向作用。

要特别主注意的：

1） 化合物对多通道的影响，对Cav1.2的抑制，一定程度可平衡对hERG的抑制作用。

2） 增强晚钠和重新激活钙电流，会出现和抑制hERG类似的作用,导致较大风险。

3） 当血药浓度达到抑制浓度范围时，选择性hERG的抑制剂和TdP相关性密切较大

以上是美国FDA给出的一个多通道抑制的例子

当化合物hERG半抑制浓度超过其在血液中的自由浓度峰值的30倍时，是一个相对安全的范围。需要注意，药物安全范围，会根据化合物相关疾病的严重性而有变化。对一些治疗致命性的疾病（例如：癌症，AIDS，严重的感染等等）的化合物，10倍范围有时是可以被接受的。30倍的范围往往适用于那些治疗严重的疾病（例如：中风， 帕金森，癫痫等等），而对于一些针对较为常规的疾病， 100倍的安全范围是比较好的。药物类型，在药品申报中，是监管机构考虑的因素。

2. 细胞水平的动作电位：

iPS诱导的心肌干细胞， 由于方便得到，常用于体外动作电位的检测

上图显示了动作电位各个时期以及对应主要功能的离子通道。

1): iPS诱导分化的心肌细胞，Ik1表达量较低，因此心室肌样细胞的静息电位和兴奋性和正常生理状态会有差异（静息电位略语去极化，Nav被轻度失活），有时需要打入一定的负电流使得静息电位到正常的水平。

2）：细胞可能混有不同种类， 心室样，心房样以及起搏细胞样都会存在。 这些细胞的电生理功能不同，导致的对化合物的反应也有差异。

3）：有报道认为对照组APD90和释放频率对药效影响显著， 因此需要根据实验室的细胞特点，选取符合标准的AP来检测。一般APD90大于300ms， 基础频率在0.8-1Hz。而且APD90稳定。

在细胞水平上，APD的延长（或者一定程度的改变）是一个有效的信号， 提示化合物的安全性问题。 APD90延长10%+，并与对照组相比有显著性差异，是众多制药公司采取的一个需要注意的范围（组织上检测APD也是同样的标准）。如果出现EAD则是一个比较强烈的，提示潜在心脏安全的信号。 其实无论在任何层面检测到EAD，都提示较大的安全风险。 早期后除极（early afterdepolarization， EAD）是在动作电位未完全复极前（即动作电位第2期和3期）发生的细胞膜不完全的去极化作用。 EAD 被认为是心室快速心律失常（polymorphic ventricular tachyarrhythmias）的诱因之一。 EAD 的产生是正向频率依赖的。 平台期 Cav1.2 通道的再次激活（re-activation）被认识是 EAD 产生的重要原因，而且Cav1.2电流也是EAD中主要的去极化电流，除了Cav1.2， 晚钠以及 NCX 都都 EAD的产生有所贡献。EAD的发生都伴随有动作电位平台期的延长（较长的平台期期有助于Cav1.2通道的恢复）。

因此， Cav1.2 和晚钠的激动剂，以及 hERG 抑制剂都可能导致EAD的产生

（E-4031：hERG抑制剂； ATXII：晚钠的激动剂）

BayK8644-1μM 作用水印（Cav1.2的激动剂）

有研究发现， Cav1.2通道被阻滞，可以抑制EAD的产生：

Cesium（铯）离子作为非选择的钾离子抑制，可以诱发EAD，当Cav1.2被不同程度的抑制后，可以改善甚至消除EAD。 这也部分解释了，多通道抑制剂的心脏安全性。

3. QT间隙延长和TRIaD：

心电图上 QT 间期是指从 QRS 波起点到 T 波终点的时程，代表心室肌细胞开始兴奋去极化到复极化结束恢复至静息状态的时间。正常值（校正后）一般男性＜430 ms，女性＜450 ms；若QT 间期男性＞440 ms，女性＞460 ms，则称为 QT 间期延长；若 QT 间期延长达到500 ms，则极易导致心律失常。一般，药物引起的QT间期延长，超过8ms就会被认为是可能导致危险。 QT 延长其实本身是无害的，一定程度的 QT 延长，是抗心律失常作用的。 QT 间隙延长会恶化成 TdP （ TdP 会进一步恶化为致死性的心室颤动，20%概率。）与 TdP 相关联的致死率， 大概为10-17%， 因此QT延长也被广泛地看成严重的心脏毒性的指标。 一般认为， 可以引起 QT 间隙延长的化合物， 比没有这种副作用的化合物， 会在易感人群中更容易引发 TdP。TdP 则是一种致命的心室过速。 药物诱发的 TdP 心律失常应该属于心室额外跳（ventricular extra beats）。TdP通常是由于具有较长复极化相位细胞产生的EAD诱发的。 TdP 可以自己终止，但也会恶化成致命的心室颤动。

上图显示了动作电位和心电图的对应关系。

单纯的 QT 延长不是完美的评价 TdP 可能性的指标， 有些具有 QT 延长作用的化物， 本身并没有导致心脏安全性的问题。因此有学者在动作电位水平有文献提出了所谓 TRIaD 的概念，它包括：动作电位三角形化（triangulation）、反向使用频率依赖性（reverse use dependence）、动作电位短期不稳定性（beat-to-beat instability）和空间复极离散度（spatial dispersion of repolarization），研究指出，在 QT 间期延长并且 TRIaD 存在的情况下会诱发 TdP 的发生。相反，如果药物只是单纯的延长 QT 间期（在一定范围内），而不影响动作电位的 TRIaD，那么该药物反而可能具有潜在的抗心律失常的作用。 TRIaD在细胞层面报道较少。

三角形化（triangulation）： 动作电位的形态会呈现“三角形”化的变化， 主要是由于复极化过程减缓所致， 而平台期延迟不显著不大。 可以用 APD90 和 APD30 的差值衡量。例如： terodiline在10μM时， 对 APD90 延长7%，而 APD90 和 APD30 的差值变化在+27%， 因此根据 APD90 的变化，terodiline 安全性较好，而三角形化测提示了较大的风险，事实上 terodiline 也因为心脏安全性，而退出市场。 一般，15%+的变化，提示了较大的风险。

反向使用频率依赖性（reverse use dependence）：在动作电位释放频率较慢时，作用显著；动作电位释放频率较快时，作用不显著。 化合物具有正向使用频率依赖性的话， 会具有抗心率失常的作用： 不会在正常的窦性性心律下发挥作用， 在心律过快时，以后延长APD，进而抗心率失常。 反向使用频率依赖性是同样的道理， 会产生严重的后果。

动作电位短期不稳定性（beat-to-beat instability）： 动作电位的 APD90 会出现不稳定的而变化，简言之，时而短时而长，不恒定（有时会表现出规律性的震荡：在一个给定的心脏跳动频率下， 较短的 APD 会后续伴随比较长的舒张期， 而较长的舒张期会后续伴伴随较长的 APD， 较长的 APD 后续伴随较短的舒张期， 然后又会产生较短的 APD，进而出现周期性的震荡）。 常规的方法是用第 n 和 n+1 个 APD90 作图。 对于稳定的动作电位而言， 连续记录的诱导的 APD， 作图结果是集中在对角线的一个点上。而不稳定的APD 得到的结果，是围绕对角线分散较为严重的散点图。 这种测量方法通常使用与非细胞水平的 APD 检测。 对于，iPS诱导的心肌细胞， 有研究直接有 APD30/50/90 对应测试时间作图。不稳定性，被一些研究认为是最有效的评价因素。

空间复极离散度（spatial dispersion of repolarization）：涉及到心脏不同部位的变化， 较为负责，在此从略， 有兴趣深入了解的可以我司具体联系。

需要注意的时， 有些人群更容易出现 TdP 。 有研究报道，较为迟缓的心率或者较大的本底动作电位时程， 都更容易被诱发 TdP . 同时女性， 低血钾浓度，低血镁浓度，具有家族相关的心脏遗传病史都会使人群更易于发生 TdP 。

举一个例子：

High risk：兔子浦肯野纤维检测到的AP， 具有明显的三角形化以及反向频率依赖

Low risk：兔子浦肯野纤维检测到的 AP，APD延长不表现出三角形化以及无反向频率依赖

多通道抑制的作用和浦肯野纤维是一致的：Verapami对hERG和Cav1.2都有作用，而Quinidine选择性抑制hERG。

兔子浦肯野纤维和豚鼠乳头肌，是较为普遍的用于化合物对 AP 影响的组织。前者不可收缩， 测量电极放置可相对简单， 得到的数据用稳定性也好；同时， 对于药物引发的 APD延长较之于其他方法更为敏感，虽然存在例外，但是兔子浦肯野纤维对于绝大多数 hERG的抑制都体现出了 APD90 的延长，这一点比其他实验要好。 豚鼠乳头肌会持续的收缩，这一点给测量AP造成一定的阻碍，有文献报道，在 AP 检测检测中，APD90 更多的对应于 IKr 和复极化；APD30 更多的对应于Cav1.2；Vmax 和 APA 对应于 Nav1.5-peak； 在一个较大规模的豚鼠乳头肌实验中，结果显示 APD， APA， Vmax 以及 RMT 都表现出一定的刺激频率依赖性， 而 APD90-APD30 则没有。此类实验对化合物的敏感性和具体实验条件相关， 例如刺激的频率（或者cycle length） ，检测的温度，动物性别，周龄以及本底的 APD 参数等等，因此实验中一定要保证实验条件的恒定；同时 APD90-30 也比单纯的 APD90 可以更灵敏的检测出潜在的心脏毒性，提示了AP的三角形化是更敏感的参数。在 S7B 中建议了关注0期的 Vmax （INa），II期的 APD30（ICa）以及III期的三角形化（Ikr）。 需要注兔子乳头肌 APD 不表现出反向频率依赖，因此不适宜用于该实验（3）下文详细论述

最后，简单图示总结一下:

4. 根据目前的文献资料，我们总结了判断潜在风险的标准：

离子通道：由于 hERG 对于正常心肌细胞的复极化发挥了最为关键的作用， hERG 是判断心脏安全性一个极为重要的标准.：

极强抑制：IC50 < 0.1µM

强抑制：0.1μM ≤ IC50 ≤1 μM

中度抑制：1μM ≤ IC50 ≤10 μM

弱抑制或无抑制：IC50 > 10 µM

以上也是我们在常规的 hERG 检测中，常用的标准。 这个标准可以给出关于心脏安全性很有效的提示， 但是全面的评估，需要更多的信息参考。

1> 任何化合物被摄入体内后，会在血液中有所分布，不同的时间点，测到的化合物在血液中的浓度是不同的， 在一定的时间范围内会达到浓度的峰值， 称之为“Cmax”; 血液中， 存在着各种各样的蛋白质， 化合物在血液中，会和血液中的各种蛋白一定程度的结合，存在着一定的“结合率”。 那么，可以计算出一个化合物在血液中没有被结合的，处于自由状态的含量 （ETPC）： Cmax X（1-结合率）。当化合物hERG半抑制浓度超过其在血液中的自由浓度峰值的30倍时，是一个相对安全的范围 （safety margins，SMs），有文献总结， 两者心脏毒性有4+倍的差别。当化合物与血浆中的蛋白结合以后， 便无法进入组织产生药效， 也不会出现各种毒性。 结合率的平均水平在80-90%， 有的甚至超过99%。

2> hERG初步筛选试验中（高通量，可能不计算 IC50 或者由于化合物溶解度限制测不到50%+抑制率）， 在30倍血浆浓度下，20%以下hERG的抑制率，提示化合物潜在的心脏毒性较低。---日本监管机构的建议 （16）

3> 心肌中多通道的抑制， 可以抵消对hERG抑制的作用， 尤其是Cav1.2， 还有晚钠

此图较好地说明这个问题： 首先两个化合物 terfenadine 和 verapamil，得到的 hERG的 IC50 和 ETCP 的比值都小于30， 从对hERG的抑制上看，都是有风险的。 但是二者对 Cav1.2 和 Nav1.5 的作用差别显著。Terfenadine 对 Cav1.2 和 Nav1.5 作用不明显，但是verapamil可以显著的抑制 Cav1.2。 讲多通道抑制的结果，图示分析，出现明显的“V”时，危险性较大； 出现“ᴧ”时，风险性较小。 所以，terfenadine 有强的心脏毒性，而verapamil 是治疗心律不齐的药物。 如果一个化合物是选择性的hERG抑制剂，潜在风险就会很大。

单纯从离子通道的角度来看，需要结合药物本身的IC50和血药浓度， 例如：tolterodine是hERG强抑制剂， IC50 在 10nM 左右。 在一般情况下， tolterodine 血药浓度较低， 所以导致的风险不大；在代谢情况不理想时，tolterodine 可以被积累，这时又会体现出对Cav1.2 的抑制作用， 因而可以平衡对hERG的抑制作用。因此，tolterodine 一直在正常使用。

动作电位： 是衡量化物潜在风险的有一个重要的指标， 可以从IPS诱导的心肌细胞和组织（常用兔子浦肯野纤维）中得到。APD90 是重要指标。 根据散落的文献，总结出以下的一些结论， 作为讨论：

1. APD90 延长在10%+，而且有统计学意义，是多数药厂采用的范围， 也是认为有生理学风险的基本值， 需要开始关注。

2. 当 APD90 的延长，在不超过20%的范围时，诱发 EAD 乃至引起心律失常的风险不严重， 由于延长了有效不应期，可能具有抗心律失常的作用；当 APD90 延长在20%+，由于显著的抑制复极化的“净电流”，而诱发心律失常的风险较大。

3. 当 APD90 的缩短，在不超过20%的范围时，有一定的抗心律失常的作用；但是缩短超过20%时，致心律失常的作用大大提高。

4. TRIaD标准。

5. 出现EAD， 强烈的提示存在心脏毒性的风险。

总结一下， APD90 的延长是一个提醒主要安全性的重要指标，但是仅仅参考APD90也会有很多潜在的风险（Tolterodine，显著延长APD90，以及有QT间期延长，但是不存在三角形化，安全。 Terodiline，缩短APD90，伴随严重三角形化，已退市）。对于重要的化合物，结合多通道抑制率（尤其是 hERG 和 Cav1.2 ），血药浓度以及兔子浦肯野纤维动作电位（APD90 延长， 三角形化，反向频率依赖）可以对化合物的心脏安全性做出一个初步的判断。

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