非典型三羧酸循环的发现及其在细胞命运决定中的作用

撰文 | 阿童木

责编 | 兮

三羧酸循环（TCA cycle）是生物体能量代谢的核心，糖类、脂肪、蛋白和核酸的碳链降解产物都最终都进入TCA循环并被分解为CO2排出体外，TCA循环的代谢中间产物也是化合物生物合成的重要前体，对生物发育及细胞稳态维持至关重要【1】。

TCA循环的过程与中间代谢物的合成【2】

越来越多的研究发现哺乳动物细胞在面对环境胁迫或生理性病变时能够通过多种策略进行代谢重编程以满足代谢需求，其中TCA循环底物选择偏好的异质性变化与关键酶活性的改变是其中的关键一环【3】，这也表明细胞能够选择性地利用TCA循环的组分，以满足特殊的生理需求【4, 5】。然而，哺乳动物细胞TCA循环活性的选择性调控机制，及其对细胞命运决定的意义，目前仍不甚清楚。

2022年3月9日，纪念斯隆凯特琳癌症研究中心Lydia Finley实验室在Nature杂志发表了题为A non-canonical tricarboxylic acid cycle underlies cellular identity的研究文章，利用代谢酶遗传共本质映射（genetic co-essentiality mapping of metabolic enzymes）分析，作者鉴定到一组基因能够介导经典TCA循环之外的一种非典型TCA循环，柠檬酸在该非典型TCA循环中被柠檬酸/苹果酸转运蛋白（SLC25A1）转运到细胞质后，会在ATP柠檬酸裂解酶（ACL）和苹果酸脱氢酶1（MDH1）的催化下依次转化为草酰乙酸和苹果酸，并再次通过SLC25A1的转运回到线粒体，实现“柠檬酸-苹果酸”穿梭。利用多种干细胞与已分化细胞模型，作者揭示了该非典型TCA循环在细胞命运转换（多能性-分化）中发挥了关键作用。

基因的共本质（co-essentiality）分析是近年来兴起的将基因系统性地聚类到生物学途径中，并鉴定基因功能的有效手段。由于参与同一调控途径的基因表现出相似的本质模式（patterns of essentiality），作者因此利用DepMap项目从全基因组CRISPR筛选中产生的基因本质性评分（gene essentiality scores）评估了参与TCA循环的酶是否会形成离散的功能性模块【6】。然而，作者意外发现TCA循环相关基因经共本质分析后会形成两个簇，Dld基因（丙酮酸脱氢酶复合物与氧代戊二酸脱氢酶复合物的共有亚基）为两个簇所共有，是两个簇间的“桥梁”。将每个簇中的基因定位到经典TCA循环中后，作者发现两个簇中的基因分别位于柠檬酸的上游和下游（图1）。一簇基因与从柠檬酸到苹果酸的途径相关（图1左）；另一簇基因参与柠檬酸到到胞质的转运，以及通过ACL催化产生乙酰辅酶A并再生草酰乙酸等过程（图1右）。那么，如果通过TCA循环氧化产生草酰乙酸过程与柠檬酸合成过程没有紧密联系，细胞如何维持柠檬酸产生呢？作者发现参与胞质柠檬酸代谢的酶（包括Slc25a1和ACL）与线粒体中参与柠檬酸合成的酶存在关联性，暗示了ACL也可能通过形成非典型TCA循环来满足细胞代谢需求，该循环能够通过持续再生草酰乙酸而支持柠檬酸的产生。

图1 经基因共本质映射分析后发现了两种类型的TCA循环

接下来，作者利用[U-13C]标记的葡萄糖在非小细胞肺癌细胞系（NSCLC）中对柠檬酸的去路进行了示踪，即柠檬酸是通过顺乌头酸酶（Aco2）等介导的经典TCA循环合成苹果酸等TCA循环中间产物，还是通过ACL介导的非典型TCA循环产生草酰乙酸和乙酰辅酶a。结果表明，利用抑制剂处理降低ACL活性会促进[U-13C]标记的苹果酸的产生，表明ACL介导的柠檬酸代谢与典型TCA循环间存在拮抗。

为确定非分化细胞中是否也存在ACL介导的非典型TCA循环，作者追踪了小鼠胚胎干细胞（ES）中[U-13C]标记葡萄糖的命运，发现抑制ACL活性同样会促进[U-13C]标记苹果酸的合成。另一方面，ACL缺陷型ES细胞中与胞质柠檬酸代谢有关的经典TCA循环中间产物的合成上调，而Aco2缺陷型ES细胞中经典TCA循环中间产物的合成受到抑制。随后，作者检测了ACL在柠檬酸再循环中的作用，发现ACL突变并不会影响乳酸和NADH的富集状态，但会使标记的柠檬酸比例显著降低，表明胞质苹果酸会被回收到线粒体中用于柠檬酸再生，并且在ACL缺失状态下，这一过程会受损。此外，ACL缺失会导致胞质NADH/NAD+比例上升，并会降低线粒体耗氧量。为进一步明确SLC25A1、ACL和MDH1能够形成非典型TCA循环，作者构建了SLC25A1及MDH1缺陷型细胞，发现与ACL功能类似，SLC25A1和MDH1对于利用胞质草酰乙酸合成柠檬酸这一过程也是必需的，SLC25A1或MDH1突变会抑制非典型TCA循环活性，并导致柠檬酸下游TCA循环代谢物的量上升。因此，SLC25A1、ACL和MDH1能够介导非典型TCA循环并协调柠檬酸代谢的跨区室（胞质-线粒体）循环。

TCA循环最早发现于鸽子的胸肌细胞中，作者因此又在成肌细胞（肌肉前体细胞，具备干细胞多能性）和分化后的肌管细胞中检测了TCA循环的选择性，发现肌管细胞利用典型TCA循环合成苹果酸等中间产物的能力显著高于成肌细胞，但肌管细胞中利用胞质草酰乙酸合成苹果酸、延胡索酸和柠檬酸的水平较弱。可见，分化后细胞中典型TCA循环的活性更强，细胞分化状态在一定程度上决定了细胞是否青睐于典型TCA循环。那么，影响细胞TCA循环类型选择性的驱动因素具体是什么呢？通过比较分化与未分化细胞的RNA-seq数据，作者发现肌源性分化会诱导典型TCA循环相关基因的表达，丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC，控制碳源进入TCA循环的水平）所有亚基的表达在分化后表达都明显上调。提高或抑制PDHC表达水平会影响碳源进入TCA循环的通量，并影响典型TCA循环代谢物的水平，以及细胞对TCA循环的选择性。

随后，作者探究了TCA循环稳态变化与偏好性在细胞分化状态与命运决定中是否是必需的呢？作者发现原始态多能性（naive pluripotency）的丧失会改变TCA循环的动态，减少TCA循环中葡萄糖衍生碳的掺入，但会增加谷氨酰胺衍生碳的掺入，表明谷氨酰胺依赖性的增强。在失去原始态多能性过程中，原始态ES细胞的经典TCA循环中间产物逐渐减少，同时伴随胞质中间体枸橼酸含量的上升。这些结果表明，ES细胞在失去原始态多能性时会从经典TCA循环活性切换到非典型TCA循环活性，TCA循环的偏好性发生了转变。进一步研究发现，干细胞退出原始态多能性状态后所发生的代谢重编程有赖于ACL介导的TCA循环代谢物的变化，且ACL能够特异性维持干细胞从原始态多能性状态退出时的细胞存活力。可见，干细胞在退出原始态多能性状态后，细胞依靠非典型TCA循环来维持TCA循环中间产物的供给并保证细胞存活力。

既然ACL会介导干细胞退出原始态多能性状态后的代谢重编程，那干细胞退出原始态多能性是否依赖于ACL呢？首先，通过检测原始态多能性marker（Rex1::GFPd2）的表达变化，作者发现抑制ACL表达后ES细胞无法退出原始态多能性状态并完成分化，且原始态多能性维持相关的基因表达上调，诱导分化的基因表达受到抑制，外源性补充乙酸盐并不能拯救上述表型。其次，SLC25A1、MDH1与ACL一起，能够确保细胞退出原始态多能性状态时重构其代谢特征（metabolic identity），而ACL受抑制会使非典型TCA 循环代谢异常，进而使细胞存活力受损。第三，典型TCA循环在细胞状态转变过程中同样发挥了作用。因此，干细胞退出原始态多能性状态也需要ACL的介导，而典型/非典型TCA循环的合理配置是细胞状态转变过程的决定因素。

综上所述，本研究利用遗传共本质映射方法鉴定到经典TCA循环之外的一种非典型TCA循环，随后利用同位素示踪和代谢酶（ACL和Aco2等）遗传操作发现在干细胞退出多能性状态过程中，会从经典TCA循环切换到非典型TCA循环，阻断该非典型TCA循环会抑制干细胞从多能性状态转变为分化状态，证实了非典型TCA循环在以干细胞多能性维持与分化为代表的细胞状态转换中发挥了关键的调控作用。

本研究在一定程度上可视为一项“范式转换”型的工作，其重要意义在于为我们理解细胞如何利用特定的代谢程序来满足其生理需求，以及细胞类型特异性的代谢程序如何为特定发育阶段的细胞提供代谢和营养支持提供了全新视角。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04475-w

制版人：十一

参考文献

1. Akram M. Citric acid cycle and role of its intermediates in metabolism.Cell biochemistry and biophysics, 2014, 68(3): 475-478.

2. Sánchez-García F J, et al. The Role of Tricarboxylic Acid Cycle Metabolites in Viral Infections.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2021: 830.

3. Kim, J. & DeBerardinis, R. J. Mechanisms and implications of metabolic heterogeneity in cancer.Cell Metabolism. 2019, 30, 434–446.

4. Yoshida G J. Metabolic reprogramming: the emerging concept and associated therapeutic strategies.Journal of experimental & clinical cancer research, 2015, 34(1): 1-10.

5. Faubert B, et al. Metabolic reprogramming and cancer progression.Science, 2020, 368(6487): eaaw5473.

6. Tsherniak, A. et al. Defining a cancer dependency map.Cell2017, 170, 564–576.

转载须知

【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究