《论语・为政》中这样记载到，多闻阙疑，慎言其余，则寡尤；多见阙殆，慎行其余，则寡悔。言寡尤，行寡悔，禄在其中矣！翻译成白话文即为少言为贵，沉默是金。
这句格言应用于人身上或许还可借鉴，但站在微生物的角度上看或许就不这么恰当了，尤其是被认为是合成天然产物药物的主力 —— 放线菌（包括链霉菌）。放线菌被广泛用于抗肿瘤药物如多柔比星、免疫抑制剂如 FK506 和杀虫剂如阿维菌素等多种药物的发酵和规模化工业制造。
然而，后基因组时代，研究者们发现放线菌基因组还有大量的沉默基因簇，蕴藏着丰富的天然产物资源，因此科研人员希望通过异源表达激活这些沉默基因簇寻找新的药物。但编码复杂天然产物的大型基因簇的克隆、编辑和激活表达，是限制放线菌活性天然产物发掘与合成的技术难点。
近日，华东理工大学生物反应器国家重点实验室和生物工程学院的张立新 / 谭高翼团队在放线菌大型基因簇捕捉和沉默基因簇激活发掘新颖活性天然产物研究中取得最新进展。该团队利用 CRISPR-Cas12a 的精准靶向切割特性和琼脂糖凝胶包埋制备高质量基因组 DNA 的技术，成功开发了一种从放线菌基因组中高效克隆 / 编辑大片段 DNA 的方法，简称 CAT-FISHING（即 “猫捕”），将其用于放线菌大型沉默基因簇的克隆和激活表达，最终实现活性新颖天然产物的发掘。
该研究以 “Activating crypticbiosynthetic gene cluster through a CRISPR-Cas12a mediated direct cloningapproach” 为题发表在国际著名学术期刊 Nucleic Acids Research 上。
（来源：Nucleic Acids Research）
借此机会，生辉 SynBio 邀请到了本文的通讯作者谭高翼与我们分享他的研究成果和科研进展。
图丨谭高翼（来源：受访者）
谭高翼于 2009 年 9 月跨专业考入上海交通大学生命科学技术学院攻读微生物学博士学位，师从钟建江教授和白林泉教授，博士期间从事链霉菌次级代谢调控和抗生素高产相关的课题。也是在博士期间，谭高翼参加了由导师负责的国家重点基础研究发展计划（973 项目）课题，认识到链霉菌 “底盘” 优化和 “元件” 设计与挖掘对微生物药物研发的意义，真正接触到合成生物学。
2014 年 3 月，谭高翼博士毕业后加入武汉大学药学院刘天罡教授课题组做博士后研究，从事天然产物异源表达和利用放线菌组学技术解析代谢瓶颈相关的研究。2016 年 10 月，他加入华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室张立新教授领衔的研究团队，目前的研究方向包括：合成生物学新技术开发与应用、次级代谢产物挖掘技术及合成与调控机制研究和工业微生物的工程改良与遗传育种。
他至今已累计发表学术论文 30 余篇，代表性成果发表在 Nucleic Acids Res, Sci Bull, Nat Commun, Metab Eng, ACS Synth Biol, Biotechnol Bioeng 等著名学术期刊上(其中包括 F1000 推荐论文和 ESI 高被引论文两篇), 论文累计被引用逾千次。申请/授权国家发明专利11项 (含 PCT 申请 3 项)。带队/指导华东理工大学本科生 iGEM (国际遗传工程机器大赛)项目，连续两年(2017, 2018)获团队金奖。担任 Nat Commun, ACS Sensor, ACS Synth Biol 等十多种 SCI 期刊论文审稿人。先后主持中国博士后基金，国家自然科学基金青年基金、面上项目等，同时担任国家重点研发计划课题负责人。
难点在于 GC 含量高且片段长
目前，比较常见的基因簇克隆技术有细菌人工染色体建库、Gibson 组装、RecET、TAR 等方法。
谭高翼表示，“上述基因簇克隆技术比如 RecET 我们在实验室也经常使用，但由于项目和研究课题的需要，我们需要从 GC 含量较高的放线菌基因组中直接克隆 120kb 或者更长的超大型基因簇，以上技术中除了细菌人工染色体可以实现外，其他方法针对高 GC 放线菌，报道片段克隆上限为 116kb。”
放线菌基因组 DNA 的 GC 含量普遍较高，大多超过 70%，这导致从中克隆获得大片段基因簇相对更加困难。谭高翼介绍道，GC 含量高会导致体外 DNA 操作困难，GC 的高频出现会产生大量重复或相似的 DNA 序列，致使 DNA 重组或片段组装时易出现错配。另外，GC 含量高的 DNA 在 PCR 时需要更高的退火温度，这也会导致 DNA 扩增失败或碱基出错等问题。
此外，由于实验室一般用的酚、氯仿等化学试剂提取的 DNA 由于技术原因易出现断裂，导致在 DNA 完整性上很难满足大片段基因簇（例如 80kb 或 100kb 以上）克隆的需求。因此，目前细菌人工染色体建库是比较经典且有效的大片段克隆方法，但这个方法的缺点是耗时费力且价格昂贵，很难用于批量克隆基因簇。
“因此我们才想到将 CRISPR/Cas12a 与细菌人工染色体方法整合，开发出能简单快速克隆超大型基因簇的方法。”
从高 GC 样品中克隆获得的最长基因簇
据谭高翼介绍，这项技术整合了 CRISPR/Cas12a 和细菌人工染色体建库技术的优势，利用 CRISPR/Cas12a 替换了细菌人工染色体建库过程中用到的限制性内切酶（例如 HindIII、EcoRI 等），即 Cas12a 在 crRNA 的引导下，精准的从琼脂糖凝胶包埋制备得到的高质量放线菌基因组 DNA 中切割出目标基因簇，随后利用 Cas12a 切割产生的粘性末端，在 DNA 连接酶的作用下，实现基因簇片段与载体的连接，实现体外直接克隆。
通过这种替换，不仅缩短了克隆步骤、操作容易简便、更省时，且克隆成本不到建库费用的 1%，这项技术也被称为 CAT-FISHING (CRISPR/Cas12a-mediated fast direct biosyn-thetic gene cluster cloning) 技术，即 “猫捕” 技术，可形象地理解为利用 CRISPR/Cas12a（猫）从放线菌中切割并捕捉出大型沉默基因簇（鱼）的技术。
图丨 CAT-FISHING 示意图（来源：研究论文）
谭高翼告诉生辉 SynBio，通过 CAT-FISHING 技术，已从 GC 含量为 75% 的放线菌基因组中克隆获得一条 145kb 的基因簇，这是目前从高 GC 样品中，通过体外直接克隆获得的最长的基因簇。
他补充道，“我们随后与浙江大学的徐飞研究员（本文共同第一作者）合作，利用 CAT-FISHING 技术，从一株小单孢菌中克隆到一条长度为 110kb 的编码基因簇，随后在链霉菌底盘中异源表达，结果获得一种新的大环内酯胺化合物 marinolactam A ，这种化合物对 HCT116 人结肠癌细胞表现出中等的抗癌活性，表明其在癌症治疗领域具有潜在价值的应用前景。”
图丨来自小单孢菌的 110kb 基因簇的克隆和异源表达
CAT-FISHING 作为一种大片段 DNA 的克隆技术，除了放线菌以外，还有更广泛的应用，例如挖掘一些丝状真菌的天然产物。CAT-FISHING 还能用于一些大型基因组岛的克隆与表征，用于开展生物学研究。该方法较为简单、快捷且成本也相对低廉。谭高翼表示，华东理工大学生工学院源起于国内最早的抗生素制造工学专业，在微生物药物的发酵和制造方面有着深厚的底蕴，团队的下一步计划是利用 CAT-FISHING 技术批量克隆基因簇，目标是构建出天然产物基因簇实体元件库，助力微生物天然产物药物的研发。
已开发多项 “CAT” 系列技术
近年来，随着 CRISPR/Cas 技术的广泛应用，与过去的技术整合也产生了系列新的基因簇克隆方法，例如基于 CRISPR/Cas9 和 Gibson 组装的 CATCH 技术、整合 CRISPR/Cas9 和 RecET 形成的 ExoCET 技术等、利用 CRISPR/Cas12a 和 loxP 位点重组的 CAPTURE 技术等。
“自 2013 年 CRISPR/Cas 技术的兴起，我一直在关注这个领域。”2017 年以来，谭高翼加入华东理工后，随即围绕 CRISPR/Cas12a 进行持续攻关和研发，迄今已经开发并形成多项 “CAT” 系列的使能生物技术。
这包括能实现微生物代谢物小分子（例如天然产物，活性小分子等）高通量、快速筛选和检测的 CAT-SMELOR (CRISPR-Cas12a- and aTF-mediated small molecule detector) 平台，以及随后升级得到的 CAT-SMELOR 2.0 平台，这不仅可向下兼容小分子检测，同时可 “即插即用” 实现对生物大分子（例如蛋白质、酶等）的高效检测；还有最近开发的 CAT-SMELOR-Covid 技术，进一步将该检测平台升级扩展到了包括病毒抗原检测在内的医学诊断领域，这些技术可以统称为 “猫嗅” 技术。
谭高翼介绍道，“以上 CAT 系列技术已申请了多项专利和相关的知识产权保护。这些都是可以扩展的通用技术平台和策略，利用这些平台技术可解决课题和项目的需求如菌种筛选平台和化合物高通量检测体系，甚至还可扩展到医学领域。未来将继续秉承生物反应器工程国家重点实验室面向生物工程学科前沿和面向国民经济主战场，促进基础科研的原始创新和产业化集成创新的理念，利用这些技术创新针对市场需求形成产品，同时期待与产业界开展深入的合作。”
参考文献：
1. Liang et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications, 2019. 10:3672
2. Zhao et al. A versatile biosensing platform coupling CRISPR–Cas12a and aptamers for detection of diverse analytes. Science Bulletin, 2021. 66: 69-77
3. Zhao et al. Integrating PCR-free amplification and synergistic sensing for ultrasensitive and rapid CRISPR/Cas12a-based SARS-CoV-2 antigen detection. Synthetic and System Biotechnology, 2021. 6: 283-291
4. Liang et al. Activating cryptic biosynthetic gene cluster through a CRISPR-Cas12a mediated direct cloning approach. Nucleic Acids Redearch. 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35323947/
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