《食品科学》：中国农科院钱永忠研究员等：数学分析法评估大蒜素对HeLa细胞氧化还原水平的影响

得益于化学结构中的巯基，大蒜素成为日常生产加工中天然广谱的抗菌、抗肿瘤、抗氧化物质，且在一定剂量范围内不会对机体造成伤害。相关研究表明，大蒜素的抗病毒、抗炎抑菌、神经保护、调节免疫、抑制肿瘤等生理功能，大多都与其诱导产生抗氧化产物调控机体氧化还原水平的能力有关。此外，大蒜素在体内外均可发挥出对氧化应激和炎症疾病的保护作用。

中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所的潘烨灿、邱 静*、钱永忠*等人拟建立HeLa细胞的佛波酯（PMA）氧化应激模型，通过中心响应面模型探究大蒜素对该模型的最佳调控条件。由于机体中复杂多变的氧化还原水平体系，又分别对受到大蒜素调控的不同组别的HeLa细胞中的SOD、GSHPx、CAT、POD、GST等生物标志物活力进行测定，并建立以层次分析法为评价标准的综合数学模型，对HeLa细胞的抗氧化能力进行综合评估。最后，通过测定各组别中的脂质过氧化标志物（MDA）及DNA氧化损伤标志物（8-oxo-dG）的含量，探究大蒜素的抗氧化调控可能的影响结果，为后续研究提供基础。

1、PMA诱导HeLa细胞氧化应激模型构建结果

如图1所示，在一定质量浓度范围内，随着细胞孵育液中PMA的质量浓度升高，HeLa细胞内的ROS含量升高；当孵育液中的PMA质量浓度一定时，HeLa细胞中的ROS水平随着孵育时间的延长逐渐趋于正常，这可能与细胞自身的修复能力有关。总之，通过实验确定了PMA诱导HeLa细胞中ROS含量升高的细胞模型，即500 ng/mL PMA孵育30 min，该条件在较短时间内ROS荧光归一化值最高，且所选孵育条件并不会影响HeLa细胞的活力，这与目前相关研究结果一致。

2、响应面法评估大蒜素对受到PMA氧化应激的HeLa细胞中ROS含量的影响

如图2所示，在2～10 mg/L大蒜素孵育提前孵育24 h后的HeLa对PMA刺激的ROS感应敏感性逐渐降低，当孵育质量浓度继续逐渐增加，ROS含量逐步上升；控制大蒜素提前孵育的质量浓度为10 mg/L，孵育时间逐渐延长到24 h时，HeLa细胞中的ROS含量逐渐降低，而时间从24 h增加到48 h时ROS含量又随即升高。这表明，大蒜素确实有调控细胞ROS表达的能力，但孵育质量浓度过低或孵育时间过短都不能达到良好的调控与保护的作用，而孵育质量浓度过高或孵育时间过长可能会给细胞本身带来一些负面的影响，从而表现出ROS含量居高不下的现象。

通过上述单因素试验结果，设计两因素中心组合水平（-1.41，-1.00，0.00，1.00，1.41）并进行全因子优化。响应面因子分别为A（孵育时间/h）（7.03，12.00，24.00，36.00，40.97）、B（孵育质量浓度/（mg/L））（2.93，5.00，10.00，15.00，17.07），再以细胞中的ROS荧光归一化值作为优化目标的响应值，利用Design Expert 8.0.5.0响应面软件进行试验设计，试验结果见表2。

利用Design Expert 8.0响应面软件对上述二因素中心组合设计响应面试验结果进行了统计学分析，结果见表3。模型的P＜0.0001，极显著，说明该模型二次方程模型具有统计学的意义；P（AB）＞0.05，不显著；失拟项P＞0.05，不显著，证明该模型拟合度良好，可预测蒜素作用HeLa细胞的氧化应激保护模型条件。大蒜素保护HeLa细胞免受PMA氧化应激的ROS响应面回归方程为Y＝1.04-2.540×10-3A-0.095B+2.500×10-3AB+0.20A2+0.24B2。该模型可用于描述不同时间、不同剂量的大蒜素孵育条件对PMA作用的HeLa细胞中ROS含量的调控能力。

根据图3所示的大蒜素孵育时间和孵育质量浓度交互影响的三维曲面图和等高线图及模型评估结果，确定了HeLa细胞在质量浓度为10.97 mg/L的大蒜素中孵育24.06 h，为保护细胞免受不良氧化应激的最佳条件。考虑实验实际操作的因素，调整大蒜素最佳的提前孵育条件为10 mg/L、24 h。结果经过实验验证。

3、大蒜素调控的生物标志物测定结果及层次分析法中的重要性评估

如图4所示，PMA可诱导HeLa细胞中的SOD、GSH-Px、CAT、POD和GST表达量降低。HeLa细胞的SOD活力会通过PMA的诱导，表达量降低大约50%，且在大蒜素孵育保护下SOD活力下调减缓，在多组测试组中5 mg/L及10 mg/L的大蒜素提前干预效果最优（图4A）。GSH-Px的表达量也会因PMA的诱导而下调约30%，若提前加入10 mg/L或20 mg/L的大蒜素孵育24 h则可以保护HeLa细胞免受PMA在GSH-Px表达中的干扰（图4B）。同时，一定质量浓度下的大蒜素也可使HeLa细胞中的CAT不受PMA的氧化应激调控，各组中的最佳孵育条件为在培养液中提前加入10 mg/L的大蒜素并孵育24 h（图4C）。HeLa细胞中的POD及GST两种氧化还原体系表达酶活力在各组别中的差异较小（图4D、E）。

若以PMA组别与空白对照组别的变异程度作为判定指标，结果如图4F所示，PMA氧化应激模型中SOD（变异度为49.25%）和GSH-Px（变异度为29.47%）的下调最为显著，CAT活力的变异度不足20%，并且POD及GST活力的变异度较其他生物标志物指标而言微乎其微，分别为2.96%、1.74%。这说明，大蒜素调控PMA氧化刺激模型下HeLa细胞的氧化还原体系中最应关注的生物标志物指标依次为：SOD、GSH-Px、CAT、POD活力和GST活力，这为后续的层次分析法中综合评分权重矩阵N提供了数据基础。

4、层次分析法对不同质量浓度大蒜素抗氧化能力的综合评价结果

根据变异度为判断指标对不同质量浓度大蒜素调控HeLa细胞抗氧化能力进行综合评判，以综合评分最高的为调控能力最优。基于层次分析法的模糊数学评价模型中的相对比较矩阵及各生物标志物指标权重结果如表4所示。

根据上述构建的调控氧化还原能力综合评分方法，对上文中的不同孵育条件组别（大蒜素+PMA）的HeLa进行抗氧化能力的综合评价。结果如图5所示，10 mg/L大蒜素提前孵育24 h后的HeLa细胞具有极好的抗氧化能力（91 分）；另外，20 mg/L大蒜素提前孵育24 h后的抗氧化能力也比较好，综合得分为90 分。因此，本实验的数学评价模型可以预测大蒜素的氧化还原调控能力。但值得注意的是，而100 mg/L大蒜素提前孵育24 h后的HeLa细胞活力降低明显，所以即使某些孵育质量浓度过高的组别获得了比较高的评分，也不能作为调控PMA氧化应激组别进行研究。

综上，在运用以生物标志物为基础的氧化还原综合评价模型时，也需要进行细胞活力的考察。

5、脂质及DNA过氧化损伤实验验证数学分析模型评估结果

根据图6所示，500 ng/mL的PMA孵育30 min可使细胞中的MDA和8-oxo-dG的含量增高，细胞发生脂质过氧化和DNA过氧化损伤；经10 mg/L大蒜素孵育24 h后给予500 ng/L PMA干预30 min的HeLa细胞组中的MDA和8-oxo-dG的含量显著低于PMA组。结果证明，各组之间过氧化损伤产物的含量变化与2.4节中的综合评估结果一致（100 mg/L大蒜素孵育24 h后的HeLa细胞活力降低明显，不纳入讨论），评价得分越低，氧化损伤产物含量越高。

结论

结果认为，细胞中ROS在大蒜素调控的过程中，SOD、GSH-Px含量或许起到了主要的作用，并且10 mg/L大蒜素提前干预24 h后的HeLa细胞在抗氧化评估中获得了最高分，这与响应面模型筛选结果保持一致。最后，通过测定各组别中的丙二醛及8-氧鸟嘌呤脱氧核苷含量，得出大蒜素的抗氧化调控与保护或修复细胞中的脂质及DNA的过氧化损伤有关，并与综合评估结果呈现一定的相关性。采用多种数学分析法研究大蒜素对HeLa细胞氧化还原水平的调控作用，克服了生物体系中复杂体系的研究困难，经过推测与验证多种途径进行分析，为大蒜素保护细胞免受PMA氧化损伤的相关机理研究提供了参考。

本文《数学分析法评估大蒜素对HeLa细胞氧化还原水平的影响》来源于《食品科学》2022年43卷3期137-145页，作者：潘烨灿，王昕璐，张琳，冯悦，贺琳娟，邱静，钱永忠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210301-014。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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