禽双RNA病毒VP3通过自噬途径降解TRAF6阻断NFKB抑制天然免疫

泛素化是一种可逆的翻译后修饰，参与多种生物学过程，包括底物蛋白稳定性、亚细胞转运和信号转导。泛素（Ubiquitin，Ub）通过酶级联反应与底物蛋白的赖氨酸（lysine，K）残基结合，包括E1激活酶、E2结合酶和E3泛素连接酶。Ub含有七个赖氨酸残基K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63结合位点，并产生多种潜在的多泛素信号。重要的是，多泛素化的类型决定了不同的生物学效应。K11、K33和K63连接的多泛素化已被证明与信号转导、蛋白质稳定性、运输和亚细胞分布有关，而K48连接的多泛素化通常参与泛素-蛋白酶体降解，维持细胞内稳定。现已发现，E3泛素连接酶通过介导宿主抗病毒免疫反应来抵抗病毒感染，而天然免疫分子TRAF6是一种E3泛素连接酶，能在NFKB/NF-κB信号通路和多模式识别受体信号通路中发挥重要作用。

近日，由浙江大学动物科学学院农业部动物病毒学重点实验室周继勇教授团队在《Autophagy》发表一篇题为“TRAF6 autophagic degradation by avibirnavirus VP3 inhibits antiviral innate immunity via blocking NFKB/NF-κB activation”文章。

首先，作者使用IBDV感染的细胞的样品进行免疫印迹分析，结果发现VP3表达条带位于40-100kDa。为了确认较大蛋白条带是否经过泛素化修饰，将VP3与泛素分子Ub共转，免疫沉淀结果表明，VP3蛋白存在多聚泛素链修饰。然而，在纯化的IBDV颗粒中未检测到泛素化的VP3，表明VP3的泛素化在病毒生命周期的不同阶段受到严格控制。总之，这些数据表明VP3在感染期间被泛素化。

然后，作者又通过质谱分析，发现VP3存在5个泛素化位点，并通过免疫沉淀实验验证确认了这5个泛素化位点是VP3发生泛素化的主要位点。并且，泛素化显著增加VP3的蛋白表达，后又经放线菌酮（cycloheximide，CHX）处理，结果发现VP3的泛素化有助于蛋白质稳定性而不是降解。

为了确定调节VP3的E3泛素连接酶，作者选取了TRAF3、TRAF6、RNF125、RNF135、TRIM25和TAX1BP1共6种宿主E3泛素连接酶蛋白与VP3共转，验证VP3蛋白的稳定性，结果发现只有TRAF6过表达明显增强了VP3蛋白的稳定性。

随后，作者又通过免疫共沉淀和GST pull down实验验证到TRAF6和VP3之间的相互作用，结果发现TRAF6和VP3存在直接相互作用。为了确定TRAF6是否作为VP3泛素化的E3连接酶，作者检测了在存在或不存在TRAF6的情况下VP3上的多聚泛素连接水平，结果发现TRAF6过表达显着增强了VP3泛素化水平。考虑到与底物蛋白的赖氨酸残基结合的多聚泛素链类型会引起不同的生物学效应，作者又检测到由TRAF6驱动的与VP3形成泛素连接类型，结果表明TRAF6是主要的E3泛素连接酶，且通过Ub K11和K33与VP3泛素化连接。随后，作者验证VP3蛋白哪个位点是TRAF6结合，免疫沉淀实验确定了VP3Lys73、135、158、193和219共5个位点均能结合。总之，这些数据表明TRAF6增强了VP3在Lys73、135、158、193和219处的K11和K33泛素化结合。为了研究VP3上的泛素化位点是否影响与TRAF6的结合，使用免疫共沉淀实验和蛋白质印迹实验检测了不同VP3突变体与TRAF6的相互作用。结果表明，VP35KR突变体完全丧失了与TRAF6相互作用的能力，VP3K135R突变体与TRAF6的相互作用也显着降低，说明VP3的K135在VP3与TRAF6相互作用中发挥至关重要的作用。

为了探索TRAF6诱导的VP3稳定性增加是否依赖于具有E3泛素连接酶活性的RING结构域，作者构建了TRAF6RING结构域突变体（C70A），结果发现TRAF6稳定VP3蛋白表达不依赖于RING结构域。随后，作者又依据TRAF6结构域，构建不同片段缺失突变体，通过免疫共沉淀实验发现，TRAF6的锌指结构域（zinc finger）在TRAF6与VP3蛋白相互作用发挥至关重要作用。值得注意的是，最近的一项研究表明锌区域可能具有E3泛素连接酶活性。因此，作者推测TRAF6介导的VP3泛素化可能是锌指结构域依赖性而非RING结构域。随后，为了研究TRAF6C70A突变体是否保留了介导VP3泛素化的能力，作者构建了多个E2结合酶并确定了UBE2D1与TRAF6和病毒蛋白VP3均能发生相互作用。

此外，通过体外泛素化试验，作者证实了由TRAF6-UBE2D1复合物驱动的VP3泛素化，与TRAF6的RING结构域无关。此外，作者还发现到VP3核积累TRAF6的锌指结构域。总之，这些数据表明VP3与TRAF6上的锌指结构域相互作用，增强VP3的稳定性和核积累至关重要。

由于IBDV感染后，诱导LC3B表达增加，TRAF6和SQSTM1表达减少，那么VP3是否能降低TRAF6表达。为此，作者对VP3和TRAF6进行了蛋白质印迹实验，结果显示VP3以剂量依赖性方式显着降低TRAF6的水平，但TRAF6 mRNA表达没有显着变化，这表明VP3影响了TRAF6的稳定性。接下来，作者又使用CHX处理评估了VP3对TRAF6半衰期的影响，结果表明，外源TRAF6的半衰期在显着缩短。然而，与WT VP3相比，TRAF6在过表达VP3（5KR）中迅速降解。此外，VP3任何泛素位点的泛素化缺失均加速了VP3对TRAF6的降解。

经药物处理发现，VP3是通过自噬溶酶体途径降解TRAF6。为了确定导致TRAF6自噬降解的蛋白，作者使用SQSTM1、OPTN、CALCOCO2、NBR1和TAX1BP1共5种受体进行免疫共沉淀实验，结果发现只有SQSTM1与TRAF6相互作用并促进TRAF6降解。

为了进一步确定负责介导TRAF6降解的SQSTM1结构域，作者构建了一系列SQSTM1截断突变体，共转染经免疫印迹实验发现，SQSTM1蛋白UBA结构域对TRAF6的降解起到关键性作用。敲除SQSTM1阻断了TRAF6的降解，同时也抑制了VP3诱导的细胞自噬。并且作者发现，IBDV VP3通过增强TRAF6与SQSTM1的相互作用促进了TRAF6的选择性自噬降解。

综合以上结果，作者发现VP3蛋白在IBDV感染期间被泛素化修饰，与TRAF6的锌指结构域相互作用促进K11和K33位泛素化结合，通过SQSTM1介导的自噬途径降解TRAF6蛋白，从而阻断NFKB介导的IFNB产生，促进病毒复制。

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