挑战二硫键“黄金标准”：科学家以紫杉醇作为模型药物，发现三硫键可用于设计肿瘤微环境响应型前药

当前，化学疗法在肿瘤治疗中仍然占据重要地位，但是它所带来的严重毒副作用也让人望而生畏。不过，化学疗法的一些毒副作用可通过制剂手段来改善。作为药物制剂的科研团队，沈阳药科大学无涯创新学院教授课题组致力于通过纳米递送策略和药物结构的优化，提高化疗药物递送效率，以达到增效减毒的效果。

图 | 孙进（来源：孙进）

此前在前药自组装纳米递送系统上，该实验室已进行大量研究。前药自组装纳米递送系统，联合了纳米制剂和前药策略的优势：载药量高且毒性小，具有打破抗肿瘤纳米药物制剂研发壁垒、推动抗肿瘤药物发展的潜力。

在化学上，二硫键（disulfide bond）是一条从结合硫醇而衍生的单共价键，大部分用于生物化学的范畴。同时，二硫键也是一种在蛋白质中大量存在的动态共价键，将二硫键引入前药结构中，可以发挥增强前药分子结构柔性、赋予前药响应肿瘤微环境氧化还原信号的作用。长期以来，二硫键一直被用作设计前药自组装纳米递送系统的“黄金标准”。目前，关于二硫键的研究非常多，这也为二硫键作为“黄金标准”的广泛应用提供了支撑。

基于此，二硫键也是该团队的研究对象之一。4 月 8 日，相关论文发表在 Nano Today（IF= 20.722 上。论文题为《由单硫键/二硫键/三硫键桥接的前药纳米组装体：探索是为了更进一步》（）[1]。

图 | 相关论文（来源：Nano Today）

研究中，教授和该院的孙丙军教授带领杨银贤博士和博士生左诗意，对二硫键的理化性质进行分析。通过分析研究，他们推测在二硫键的基础上，可以增加一个硫原子，借此有望得到一个“加强版”的二硫键，也就是三硫键。

图 | 从左至右：孙进教授、孙丙军教授、杨银贤博士、博士生左诗意（来源：该团队）

曾首次挑战二硫键“黄金标准”

经查阅文献，他们发现目前尚未有三硫键在药物设计和药物递送领域的相关报道。2020 年，该团队首次对二硫键这一“黄金标准”提出挑战，其将三硫键插入到阿霉素（DOX，doxorubicin）同源二聚体前药中，成功得到了兼具高载药量、高自组装稳定性和高肿瘤选择性三大优势的纳米制剂，相关论文发表于 Science Advances 上 [2]。

其中，DOX 前药是由稳定的酰胺键连接三硫键和 DOX 分子。而酰胺键在生理条件下很难水解断裂，这导致 DOX 前药无法释放出 DOX，而是转化成与 DOX 活性相当的硫醇中间体 DOX-SH。因此，对于 DOX 前药来说，通过 DOX-SH 就能发挥药效。

但是，大多数前药仍然需要释放出母药才能发挥作用。比如，以临床应用非常广泛的紫杉烷类药物为例，通常是在 C-2’位羟基对其进行结构修饰，这也是它发挥药理活性的位点。

在设计这类药物时，需要保证在发挥活性阶段能够完全脱除修饰基团。另外，三硫键桥连的 DOX 前药，仅是表现出很好的还原敏感性。而团队推测，三硫键可能也具有类似二硫键的氧化敏感性。

在前期工作中，他们发现对于自组装体系的性质来说，母药本身的理化性质也有很大影响。以该团队目前正做的紫杉烷类药物为例，通过结构修饰可以很好地自组装，不仅不容易结晶，而且自组装可控，制剂粒径也不会很大。

但是，羟基喜树碱在这种体系中结晶趋势很强，它会形成针状结晶，粒径很大，因此很难控制。对于具有平面大 π 环结构的阿霉素，其可控自组装存在一定难度。可以说，前药自组装体系的设计没有一个简单通用的公式，选择不同的模型药物可能会获得不同结果。而三硫键能否应用于其他药物前药自组装体系，仍需更多试验来说明。

因此，本次工作是对此前未涉足区域的探索，并对之前未考察的问题提供解答。期间，孙进等人选择紫杉烷类药物的代表——紫杉醇作为模型药物，对前药的组装和释放等进行更透彻的研究，也对前药纳米粒的体内药物动力学和药效学加以研究。

该团队表示：“正如论文题目里面写的‘Exploration is for going further’，即我们希望能通过这些研究去推动三硫键和前药自组装纳米递送系统的科研进展。”

（来源：Nano Today）

以紫杉醇作为模型药物，深入研究前药的组装和释放

前面说到，二硫键是该领域的“黄金标准”。在前期工作里，他们发现一些单硫键或二硫键桥连的紫杉烷类小分子前药，能在水中自发形成稳定均一的纳米粒，并且具有氧化还原敏感性，从而能在肿瘤部位智能地释放药物。

但是，二硫键并不是设计自组装前药分子的“万能钥匙”。孙进表示：“我们发现对于结构刚性增强的二聚体前药（一个前药分子中含有两分子母药），二硫键提高前药自组装能力的作用有限。考虑到针对肿瘤氧化还原微环境敏感的化学桥连种类较少，我们认为开发新型智能响应型化学桥连，对于前药自组装纳米粒具有重要的研究意义和实用价值。”

因此，以上问题也成为他们基于二硫键做深入研究的“指路灯”。而化合物的合成，便是第一步。本次课题里的三硫键化学桥连、以及单硫/二硫/三硫键桥连的前药化合物，都需要课题组自己合成，这也是需要克服的首个难关。

合成成功之后，该团队要进行前药组装能力的考察和其纳米制剂的制剂学表征，这对制剂质量控制和评价非常重要。因为药物进入体内之后，会经历非常复杂的过程，而不同前药制剂的稳定性参数则可预测它们的体内行为。

孙进表示：“我们对前药纳米制剂的氧化还原性也进行了考察，这部分性质对于前药纳米制剂的安全性和有效性都很关键。之后，又进行细胞水平上的研究，包括在不同种类的肿瘤细胞上评估此次前药纳米制剂的细胞毒性和摄取效率等。”

同时，他们也选取正常组织细胞，就前药纳米制剂针对肿瘤细胞和正常细胞的选择性，分别做出评价。最后，在动物模型中进行药代动力学、体内分布和药效学的研究，并且评估前药纳米制剂的安全性。

（来源：Nano Today）

在肿瘤微环境响应型前药或纳米递送系统中，具有广泛应用前景

在应用前景上，该团队很有信心：“我们相信针对三硫键的研究，会为药物研发和疾病治疗带来一些改变。作为一种新型的氧化还原敏感键，三硫键是具有广泛的应用前景。首先，它在肿瘤微环境响应型前药或纳米递送系统中具有广泛的应用前景，而我们目前只是在小范围内进行了应用。”

要知道，在设计前药或纳米递送系统时，需要考虑如何区分肿瘤细胞和正常细胞。只有这样，才能让前药有选择地在肿瘤部位降解成活性药物，或是让纳米粒选择性地向肿瘤部位释放活性的药物。

而肿瘤微环境具有一些不同于正常生理环境的特征，例如肿瘤微环境处于高表达氧化还原水平的状态，这为区分肿瘤和正常组织提供了很好的机会。因此，利用三硫键这种氧化还原超敏感的化学键，可以很好地构建肿瘤微环境响应型药物递送系统。

另外，还有一些疾病模型也具备异于正常生理状态的氧化还原水平，比如心血管病、糖尿病和炎症性疾病。在这些疾病模型中，利用三硫键触发药物的治疗也是一个可行的设计思路。

此外，在维持细胞的生理活动中，细胞的氧化还原稳态发挥着重要作用，它也是感知细胞生理活动和功能的一个窗口。如果把三硫键与成像技术结合起来，比如引入到荧光探针中，是不是就可以把细胞氧化还原状态转换成可视化的信号，进而达到监测细胞生理活动的目的呢？这或许是课题组的下一个研究目标。

（来源：Nano Today）

“可能就差这临门的一脚”

对于本次研究，孙进特别提到论文作者杨银贤是个勤奋刻苦的学生。为保证课题顺利进行，他阅读大量文献并进行多次尝试，但在最初半年依旧没能合成目标化合物。

“他从一开始的信心满满到最后开始怀疑这个东西是不是真的能做出来，于是找到我说想要放弃了，想换其他方向做。我听完他的进展后给他分析了几点，并且鼓励他越是这种时候越要沉得住气，再坚持一下，可能就差这临门的一脚了。”孙进说。

随后，杨银贤又和孙丙军老师进行深入分析和讨论，提出了潜在解决方案。有天，杨银贤抱着试一试的想法投了一个反应，结果成功了，并且还将后续合成路线予以打通。杨银贤自述，那一次的反应是最成功的，之后用同样方法再做都没有那么高的产率，所以后面他们又对方法进行了调整。

完成实验之后，便是论文投稿。在第一次投 Nano Today 的时候，他们被拒稿了。不过课题组分析后认为，审稿人提出的问题是可以被解答的。所以在对论文进行修改和补充试验后，重投了本次论文，经历第二轮审稿后最终成功接收。

（来源：Nano Today）

“我们遇到的审稿人都非常博学严谨，在与他们‘答辩’的过程中也引发我们对实验现象做更深入的思考。比如，对于抗肿瘤药物细胞毒性的考察，前药需要释放成母药才能产生细胞毒性，而这个释放过程就给细胞毒性的产生带来了一些‘变数’。这让我们意识到，应该适当地将肿瘤细胞本身的增殖能力和对药物的作用如 P-gp 蛋白介导的外排转运这些因素考虑进去。当理论上的认识和试验结果有出入的时候，这不一定是试验结果有问题，很有可能是在提示我们要换个角度思考。”孙进总结称。

一篇论文有时就像一台节目，演出结束之后，对于观众来说就是结束，但对于演员来说，依然有可以继续打磨的地方。科研也是如此，该团队表示在本次研究中，他们重点考察了三硫键前药的成药性和转化前景，也通过更合适的肿瘤模型，进一步评价制剂的药效学和安全性。同时，尝试开发出三硫键桥接的 SN-38 同源二聚前药，但由于 SN-38 结构中来自吡啶的氮原子可以攻击三硫键，导致前药快速地发生自降解，使得这一部分的研究无法进行下去。这也提示着他们，在设计前药自组装体系时，需要充分考虑母药的理化性质。

（来源：Nano Today）

孙进也提到：“基于三硫键的研究，目前我们正在进行更多硫原子的四硫键在药物递送的研究。并且计划将三硫键应用于基因递送的脂质材料中。”

据介绍，对于肿瘤细胞中较高的 GSH 发生断裂和降解，二硫键桥连的脂质可以做出智能响应，从而促进药物高效解离释放出来，借此提高 mRNA 递送效率。相比于传统的二硫键，三硫键不但具有更高的 GSH 敏感性，还能高效消耗细胞内的 GSH，促进 mRNA 的翻译。

并且，三硫键能够释放出 H2S气体，其自身具有增强免疫应答和改善免疫抑制的作用，从而促进树突状细胞的激活与抗原提呈能力。所以，开发多硫键桥连的新型阳离子脂质，可从多方面提高mRNA的递送和表达效率，同时协同肿瘤免疫激活增强免疫应答。

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参考：

1、Yang, Y., Zuo, S., Zhang, J., Liu, T., Li, X., Zhang, H., ... & Sun, J. (2022). Prodrug nanoassemblies bridged by Mono-/Di-/Tri-sulfide bonds: Exploration is for going further. Nano Today, 44, 101480.

2、Yang, Y., Sun, B., Zuo, S., Li, X., Zhou, S., Li, L., … & Sun, J. (2020). Trisulfide bond-mediated doxorubicin dimeric prodrug nanoassemblies with high drug loading, high self-assembly stability, and high tumor selectivity. Science advances, 6(45), eabc1725.