兽医诊断制品试验研究技术指导原则（征求意见稿）

各有关单位：

为进一步加强兽医诊断制品研究技术指导工作，我中心按照《兽医诊断制品注册分类及注册资料要求》（农业农村部公告第 342号），起草了《兽医诊断制品试验研究技术指导原则（征求意见稿）》（附件 1），现公开征求意见，请各有关单位认真研究，并于 2022年 5月 31日前将书面意见（附件 2）发送至 shengyao3564＠ 163.com。

联系人：王芳，联系电话： 010-62103578。

附件： 1.兽医诊断制品试验研究技术指导原则（征求意见稿）

2. 《兽医诊断制品试验研究技术指导原则（征求意见稿）》征求意见表

农业农村部兽药评审中心

2022年5月10日

附件1

兽医诊断制品试验研究技术指导原则

（征求意见稿）

1 目的 为兽医诊断制品的研制提供原则性指导。

2 背景 根据《兽药管理条例》中的有关规定，兽医诊断制品属于兽药。兽医诊断制品的申报和审批程序，与预防和治疗类兽用生物制品相似。但是，兽医诊断制品的研制内容和申报资料项目要求仍具有其特殊性。

3 兽医诊断制品的主要技术指标

3.1 敏感性 包括分析敏感性和诊断敏感性。分析敏感性是指制品能够检测出样本中被分析物的最小量，即最低检出量。诊断敏感性是指制品能够检测出已知阳性样本的阳性率。

3.2 特异性 包括分析特异性和诊断特异性。分析特异性是指制品将检测的目的因子与其他因子区分开来的能力。诊断特异性是指制品能够检出已知阴性样本的阴性率。对抗体检测制品，除对已知未感染（未免疫）动物样本的阴性率外，还应通过检测与目标疾病病原存在交叉反应的相关病原免疫的动物血清或自然感染血清的交叉反应来确定。对抗原及核酸诊断制品，除对已知未感染（未免疫）动物样本的阴性率外，还应通过检测与目标疾病病原存在交叉反应的抗原或基因的交叉反应来确定。

3.3 重复性 一般以变异系数表示。即用诊断制品对已知的阴性、弱阳性、强阳性样品进行多次测定，计算检测结果的变异系数，确定方法的可重复性。变异系数必须在可接受的范围内。

3.4 符合率 是指采用不同方法对相同样品检测结果的一致程度。

3.5 适应性 是指在不同环境条件下诊断制品检测结果的可靠性。

4 试验设计要点

4.1 在设计试验时，应根据《兽药注册办法》《兽医诊断制品注册分类及注册资料要求》中的有关要求（如诊断制品的试验项目、试验批数、试验数据）及上述主要技术指标进行试验设计。

4.2 实验室试验

4.2.1 对采用完整病原体制备抗原或血清的产品,应对病原体进行以下鉴定。

4.2.1.1 生物学特性。应明确病原体的来源、血清型或基因型和培养特性。

4.2.1.2 纯粹或纯净性 应进行无菌、纯粹、支原体、外源病毒等检验。一般应采用《中国兽药典》收载的方法。无标准方法的，可采用自行建立的方法，但须进行方法确认。

4.2.2 对采用人工合成或基因重组表达技术制备的抗原，应提供选择依据，进行不同序列抗原的比较试验，提供的试验数据应能证明所采用的抗原是最佳选择。还应采用自然感染或人工免疫获得的抗体进行验证，必要时，应提供与采用常规方法（如完整病原体提取）制备的抗原的比较试验数据，以证明合成或重组表达抗原与诊断目标抗原的同源性。

4.2.3 对采用人工合成或基因重组技术制备的引物或基因片段，应提供选择依据，进行不同序列引物的比较试验，提供的试验数据应能证明所采用的引物序列是最佳选择；应对引物或基因片段进行序列测定，以证明该序列与诊断目标相关基因序列的同源性。

4.2.4 对于使用人工合成或基因表达抗原制备的抗体，应经自然抗原进行验证。

4.2.5 生产工艺研究

4.2.5.1 抗原、抗体、核酸、多肽等主要物质的制备和检验。对于抗原，应包括培养方法、浓缩纯化方法、效价及特异性测定等。对于抗体，应包括制备用动物种类、免疫剂量、免疫途径、免疫次数、采集时间、抗体纯化方法、标记方法、效价和特异性测定等。对于核酸、多肽等，应包括鉴定方法和鉴定标准等。

4.2.5.2 阴、阳性对照品的制备和检验。阳性对照品制备和检验研究中含量或效价等结果应采用研发试剂盒之外的方法进行确认。

4.2.6 诊断试验反应条件的研究。包括载体、配套试剂、反应时间等，需通过不同试验条件下的比较试验确定最佳的实验参数。对于免疫学类制品，试验条件的筛选可结合抗原、抗体的效价及敏感性、特异性测定方法同时进行。对于分子生物学类制品，试验条件的筛选可结合引物设计、基因扩增及敏感性和特异性测定方法同时进行。

4.2.7 诊断制品检测临界值与结果判定标准确定的研究。应根据制品方法原理、产品用途，结果判定方法等采用符合统计学要求的样本数量进行研究，根据统计学等科学方法确定诊断制品临界值与结果判定标准。

4.2.8 试剂盒的组装及成品检验 在制备所有试剂盒组分并经半成品检验合格后，可进行试剂盒组装。组装时，应根据实际应用情况来确定每个试剂盒的试剂用量，采用最方便使用的包装。

4.2.9 质控样品的制备、检验和标定

如成品检验所用质控样品为非国际或国家标准品（参考品），应制定检验标准、确定标定方法，提供检验报告和标定报告等。质控样品标准一般应包括定量或定性指标，测定方法原则上应使用金标准方法或经典方法，不能用本制品的方法。敏感性质控品应邀请不少于2个外部实验室进行协作标定。质控样品类型应满足以下要求。

4.2.9.1 免疫学类诊断制品

4.2.9.1.1 用于检测抗原类制品。敏感性质控品通常为特定含量的灭活病原。特异性质控品除阴性样品外，还应包括可能出现交叉反应的其它病原。

4.2.9.1.2 用于检测抗体类制品。敏感性质控品通常为特定效价的阳性血清。特异性质控品除阴性样品外，应包括出现交叉/干扰反应的其它血清。还应根据产品组分、工艺过程确定可能与检测标的物产生非特异性反应的其他样品，如生产包被抗原时所用细胞、表达载体等的阳性血清等。

4.2.9.2 分子生物学类诊断制品

敏感性质控品通常为一定含量的灭活病原或特定拷贝数的质粒。特异性质控品除阴性样品外，还应包括可能出现交叉反应的其它病原或核酸。

4.2.10 诊断制品成品检验项目和标准的确定

4.2.10.1 性状检验 应确定诊断制品的包装及内容物的外观性状和标准。

4.2.10.2 无菌检验 根据试剂盒用途、组分特性等确定，对污染后可能影响结果判定的液体组分，应按《中国兽药典》进行无菌检验。

4.2.10.3 敏感性检验 对系列稀释的敏感性质控品进行检测确定分析敏感性（最低检测限）。

4.2.10.4 特异性检验 对特异性质控品进行检测确定分析特异性。

4.2.11 诊断制品质量研究

诊断制品应开展敏感性、特异性、重复性研究，对于创新型诊断制品，还应进行比对研究，其结果应满足制品作用与用途的要求。

4.2.11.1 敏感性研究

4.2.11.1.1 分析敏感性研究 将一定数量已知抗原含量或抗体效价的样品进行系列稀释后，使用至少3批诊断制品进行检测，确定制品的分析敏感性（最低检测限）。

4.2.11.1.2 诊断敏感性研究

应使用至少3批诊断制品对已知阳性样品进行试验，样品数量应满足统计学要求，样品类型应根据制品特性、作用与用途等设定，一般应包括或满足以下要求（1）已知感染和免疫动物样品；（2） 经经典（参考）方法确认的阳性样品；（3）经经典（参考）方法确认的弱阳性样品或测定结果接近阴阳性临界值的阳性样品；（4） 主要的基因型/血清型样品；（5） 如制品用于检测多种动物，应包括每种动物的检测样品；（6）制品所适用的每种样品类型（如全血、血清、血浆、口腔液、粪便等）；（7）有国际或国家标准品（参考品）的，一般应包含这些参考品。

将诊断制品的检测结果与经典（参考）方法的检测结果进行比较，样品的检测结果如与已知敏感性样本的感染状态或与经典（参考）方法的检测结果相一致，则判为真阳性（TP），如不一致，则判为假阴性（FN）。根据比较结果确定诊断制品的诊断敏感性。

经典（参考）方法阳性

制品方法阳性

真阳性（True Positive，TP）

制品方法阴性

假阴性（False Negative，FN）

诊断敏感性（DSe）=TP/(TP+FN)×100%

4.2.11.2 特异性研究

4.2.11.2.1 分析特异性研究 应使用至少3批诊断制品对一定数量的已知阴性样品进行试验。

4.2.11.2.2 诊断特异性研究

应使用至少3批诊断制品对经经典（参考）方法确定的无被检标的物样品进行试验。样品数量应满足统计学要求，样品类型应符合以下要求。

（1）免疫学类制品

用于抗体检测的免疫学制品特异性样品至少应包含（1）已知阴性样品；（2）可能存在交叉反应的其他病原或不同血清型病原的阳性血清；（3）制备抗原所使用的细胞和/或表达载体的阳性血清；（4）作用与用途中涉及的样品类型，如血清、组织液等。

用于抗原检测的免疫学制品特异性样品应至少包含（1）已知阴性样品；（2）可能存在交叉反应的其他病原或不同血清型病原；（3）作用与用途中涉及的样品类型，如血清、组织液等。

（2）分子生物学类制品

特异性样品应包括（1）已知阴性样品；（2）可能存在交叉反应的其它病原体或核酸；（3）可能存在交叉反应的不同血清型、基因型的病原（核酸）或国内主要流行的其它血清型、基因型病原（核酸）；（4）作用与用途中涉及的样品类型，如血清、拭子和各种组织样品等。

将诊断制品的检测结果与经典（参考）方法的检测结果进行比较，样品的检测结果如与已知特异性样本的感染状态或与经典（参考）的检测结果相一致，则判为真阴性（TN），如不一致，则判为假阳性（FP）。根据比较结果确定诊断制品的诊断特异性。

经典（参考）方法阴性

制品方法阴性

真阴性（True Negative，TN）

制品方法阳性

假阳性（False Positive，FP）

诊断特异性（DSp）=TN/（TN+FP）×100%

4.2.11.3 重复性研究。应使用至少3批产品及批内不同制品（每批至少5个）对已知阴性、弱阳性、强阳性样品进行至少4次重复测定，计算批内、批间变异系数，确定该制品的重复性检验方法和标准。

4.2.11.4 适应性研究。对创新型兽医诊断制品，应进行适应性研究。由不少于3家兽医实验室（分布于不同省份）对3批诊断制品进行适应性检测（包括敏感性、特异性），并出具评价报告（含批内、批间差异分析）。

4.2.11.4.1 比对试验方案制定

应根据制品用途制定比对试验方案。制定试验方案时，应确定以下内容：兽医实验室、抽样方式和数量、评价参数等。

比对试验所需样品和诊断制品通过符合要求的运输方式送达各兽医实验室。各兽医实验室应采用统一的试验方案和数据统计分析方法及记录格式，独立开展比对试验。各兽医实验室将测定结果进行统计分析，根据评价指标形成各自的实验室结果。研制单位将参与比对实验室的实验结果汇总后，进行整理、统计分析，形成评价报告。

4.2.11.4.2 兽医实验室的选择

参与比对试验的兽医实验室应具备相应的技术能力（包括专业技术人员和相应的仪器设备）。

4.2.11.4.3 抽样方式和数量

为保证结果具有统计学意义，诊断制品的数量必须满足一定的要求。采取随机取样的方法抽取同一批次内诊断制品开展比对试验来进行批内差异分析。

所用样品应包括一定数量的阳性、弱阳性、阴性等各类临床样品，总样品数量应不少于30份。样品按编盲方式进行比对。

4.2.11.4.4 比对试验评价参数

评价比对试验应根据诊断制品的用途确定，一般包括分析敏感性、分析特异性、诊断敏感性、诊断特异性。

（1）分析敏感性：同4.2.11.1.1

（2）分析特异性：同4.2.11.2.1

（3）诊断敏感性：同4.2.11.1.2

（4）诊断特异性：同4.2.11.2.2

4.2.11.5 保存期研究 应将至少3批诊断制品在适当条件下保存，并间隔一定时间，按成品质量标准中核心指标进行检测，并与原始成品检验数据进行比较，确定诊断制品的保存条件和有效期。一般情况下，试验过程应持续到所规定的保存期后1个月。

4.2.11.6 符合率研究 应选择已知阳性、弱阳性、阴性样品，进行诊断制品与其他诊断方法比较的试验研究。

4.3 中试生产 按照实验室试验确定的生产工艺在兽医诊断制品GMP生产车间连续生产至少3批诊断制品，按照确定的成品检验标准进行全面检验。

根据中试生产情况，可对生产工艺进行适当调整，使其更能适应工业化生产。

对于创新型兽医诊断制品，中试生产批数至少6批。

4.4 临床试验报告

采用一定数量的试剂盒对临床样品（包括阳性和阴性样品）进行检测，分析诊断制品的实际应用效果。

来源：中国兽医药品监察所