SARS-CoV-2 N与G3BP结合来拮抗应激颗粒和IFN产生促进病毒复制

SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎对全球健康构成重大威胁。与SARS-CoV和MERS-CoV的NP类似，SARS-CoV-2的NP通过靶向RIG-I信号抑制I型干扰素的产生，但对这个过程背后的机制知之甚少。

2022年6月2日，北京生物工程研究所刘萱研究员团队在《Journal of Virology》发表一篇题为“SARS-CoV-2 N Protein Antagonizes Stress Granule Assembly and IFN Production by Interacting with G3BPs to Facilitate Viral Replication”的文章，阐述NP与G3BPs结合来拮抗应激颗粒产生，调控天然免疫反应的机制研究。

研究结果一：G3BPs直接与β冠状病毒的NPs相互作用。

为了研究SARS-CoV NP相关的蛋白质，作者先通过IP再经过MS/LC-MS技术进行筛选，发现G3BP1和G3BP2两个蛋白具有较高信号，如下图。表明SARS-CoV NP可能与G3BPs相互作用。

为了研究这种相互作，作者通过免疫共沉淀实验发现G3BP1和G3BP2均与NPSARS-CoV、NPSARS-CoV-2和NPMERS-CoV存在相互作用，如下图。表明G3BPs与β冠状病毒的NPs存在相互作用。

接下来，作者通过体外结合实验（原核表达NP）、SPR和PLA实验技术，发现NP与G3BPs存在直接相互作用，如下图。

研究结果二：G3BPs与NP结合依赖于RNA

为了验证参与G3BPs-NP结合的结构域，作者分别构建了G3BP1和NP截短突变体，通过免疫共沉淀实验验证发现G3BP1蛋白N末端的核转运因子2样(NTF2L)结构域是与NP结合的重要结构域，NP CTD结构域是G3BP1结合重要结构域，如下图。

由于SARS-CoV-2是RNA病毒，NP是核衣壳蛋白，所以作者使用RNaseA消化验证这种结合是否依赖于RNaseA。通过免疫共沉淀实验发现，RNaseA显著抑制了NP与G3BPs结合，并且截短的G3BP1和NP之间或G3BP1/G3BP2和截短的NP之间的相互作用没有被RNaseA消化完全破坏，如下图。以上结果表明，RNA影响NP与G3BPs的结合。

研究结果三：SARS-CoV-2 NP抑制G3BP介导的SG形成。

应激颗粒(Stress granules，SG)是由mRNA和蛋白质组成动态的大细胞质聚集体，以应对细胞内应激，例如氧化应激和病毒感染。SG形成导致病毒传感器的募集和强大的翻译停滞，这可以阻止病毒基因表达。与mRNA相关的G3BP1和G3BP2是SG成核的重要成分。此外，G3BP1通过正向调节RIG-I和cGAS介导的细胞抗病毒反应来抑制病毒复制。现已发现G3BPs蛋白NTF2L结构域在G3BP二聚化和向SG募集中起着至关重要的作用。亚砷酸钠(sodium arsenite，SA)常用于细胞内应激颗粒诱导剂。通过荧光显微镜观察发现，SA处理增强了NP与G3BP1的共定位，同时也发现SARS-CoV-2感染也抑制了SA诱导的SG组装，且过表达G3BP1或G3BP2可以显著恢复SG的形成，如下图。

研究结果四：SARS-CoV-2 NP抑制G3BP1依赖性IFN的产生并促进病毒复制

现已发现G3BP1通过RNF125介导的K48多泛素化连接增强RIG-I激活，从而导致IRF3磷酸化和促进IFN-β表达。作者发现G3BP1诱导IRF3磷酸化和IFN-β产生，同时也发现NP抑制G3BP1诱导的IRF3磷酸化和IFN-β产生，如下图。另外还发现在没有G3BP1情况下，NP抑制IRF3磷酸化和IFN-β产生作用较弱。以上结果表明，NP拮抗G3BP1介导的IRF3磷酸化和IFN-β的产生。

通过分析SARS-CoV-2感染细胞后，G3BP1对SARS-CoV-2 dsRNA变化。结果发现G3BP1与SARS-CoV-2 dsRNA存在共定位。而沉默G3BP1则dsRNA表达量显著增加，如下图。

通过沉默G3BP1检测细胞培养上清中病毒RNA水平，荧光定量检测发现沉默G3BP1促进病毒基因组RNA复制，如图F。同样，敲除G3BP1促进病毒基因组RNA复制，恢复G3BP1表达则抑制病毒基因组RNA复制，如下图G。

作者使用条件性敲除G3BP1小鼠，特异性敲除II型肺泡细胞中的G3BP1基因。检测发现敲除G3BP1显著促进小鼠体内SARS-CoV-2的病毒载量，如下图。以上结果表明，G3BP1在SARS-CoV-2感染诱导的天然免疫中起重要作用。

综合以上结果，作者发现SARS-CoV-2 N蛋白与G3BPs结合，抑制应激颗粒形成，抑制天然免疫反应，进而促进SARS-CoV-2复制。

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