丰培强等揭示过氧化物酶体蛋白转运新机制

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过氧化物酶体(Peroxisome) 是一类普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它最早在1954年由瑞典人J. Rhodin首次发现，随后在1967年被比利时细胞生物学家Christian de Duve正式确立为细胞器并且被命名 (Christian de Duve因为发现过氧化物酶体和溶酶体而分享了1974年诺贝尔生理与医学奖)。其主要功能是参与细胞内长链脂肪酸的氧化，活性氧的淬灭，以及脂类小分子的合成。过氧化物酶体功能的紊乱和丧失会引发多种人类疾病，比如：神经系统发育障碍，新生儿肾功能和肝功能不全以及肌张力减退等现象。

过氧化物酶体内部的合成代谢反应大部分都是由各种酶来完成的，这些蛋白都需要从细胞质中合成然后转运到过氧化物酶体基质内。首先，携带信号肽的货物蛋白在细胞质中被受体Pex5所识别形成复合物，并且被招募到过氧化物酶体表面。然后，货物蛋白会通过一种尚未明确的机制穿过膜并且释放到过氧化物酶体基质侧。有意思的是，在这个过程中Pex5会跟随货物蛋白一起进入过氧化物酶体内部。因此，Pex5为了进行多轮的蛋白转运，必须重新穿过膜完成逆向运输返回到细胞质一侧参与新一轮的蛋白运输，而这一过程依赖于Pex5蛋白的单泛素化修饰 (mono-ubiquitination)。

泛素化修饰是普遍存在于真核细胞中的一种蛋白翻译后修饰，它通常是由3种不同的酶介导的一个化学级联反应，其中最后一步反应是由泛素连接酶来完成的。参与Pex5 mono-ubiquitination的泛素连接酶是定位于过氧化物酶体膜内的泛素连接酶复合物(Ubiquitin ligase complex)，它包含3个成员:Pex2、Pex10和Pex12，这三个蛋白都属于RING家族的泛素连接酶。蛋白转运的最后一步是完成mono-ubiquitination的Pex5被结合在过氧化物酶体表面的ATP酶复合物 (Pex1/Pex6 complex) 从膜里面提取出来并释放到细胞质中，从而进入新一轮的蛋白转运循环。在这个过程中，有两个重要的问题一直没有得到解决：1. 货物蛋白和Pex5如何跨膜进入过氧化物酶体内部。2. Pex5自身如何逆向穿过过氧化物酶体膜回到细胞质中。

2022年6月29日，来自哈佛大学医学院的Tom Rapoport(HHMI Investigator) 实验室在Nature上发表了题为A peroxisomal ubiquitin ligase complex forms a retrotranslocation channel的研究论文 (丰培强博士为第一作者和共同通讯作者)，为第二个问题提供了解答。该研究报道了过氧化物酶体膜上的Ubiquitin ligase complex的冷冻电镜结构,并且结合一系列生物化学和细胞生物学实验揭示了该复合物作为Pex5的逆向转运通道的新功能，该研究同时还阐释了由两条不同的泛素化通路所介导的Pex5转运的全新机制，极大的促进了人们对于过氧化物酶体蛋白输入系统的认识和理解。

在本研究中，作者首先利用真核细胞体系异源表达来自嗜热真菌Thermothelomyces thermophilus的泛素连接酶复合物的三个组分Pex2、Pex10和Pex12并且成功的纯化了高质量的复合物。为了解决复合物体积偏小的问题，他们与芝加哥大学的Anthony Kossiakoff实验室合作筛选可以结合该复合物的抗原结合片段 (Fab) 来增大复合物胞外结构域。最终他们得到了结合Fab的泛素连接酶复合物的稳定样品，并且成功的利用冷冻电镜的方法解析了分辨率接近3.1Å的复合物三维结构（图1）。非常令人惊讶的是，结构展示该复合物的跨膜结构域总共包含15个跨膜螺旋 (TM)，这与之前通过疏水性预测的结果完全不同。他们还发现这15个跨膜螺旋在膜内共同形成一个直径大约为10Å的中央孔道，围绕在中央孔道附近的TM多数为两亲性质的α螺旋，上面分布着许多保守的亲水氨基酸朝向孔道的中间（图2）。酵母体系的蛋白输入实验结果表明孔道的开放程度会直接影响Pex5的逆向转运，并且对于货物蛋白的输入是必要的。

图1. 过氧化物酶体泛素连接酶复合物整体结构

图2. 中央通道结构模型图

进一步的结构分析发现，除了跨膜结构域之外，该复合物还包含一个胞质结构域。该结构域由三个分别来自于三个组分的RING finger (RF) 堆叠形成。通过一系列的体外生化重组和体内的蛋白输入实验，作者证明RF2介导的mono-ubiquitination 可以帮助Pex5进行循环转运，而RF10-RF12复合物可以作为一个独立的功能单元催化Pex5发生Poly-ubiquitination，使其最终降解，这两条通路都可以帮助Pex5完成逆向转运。此外，作者从结构上也为这个结论找到了理论支撑，他们发现Pex10蛋白中负责连接TM和RF10的一段柔性肽段被埋在跨膜区内，但是却不与任何周围的TM产生互作，因此他们将这段序列命名为plug。如果将plug从结构中移除，将在跨膜区中央孔道的旁边产生另一个大的亲水空间，为Pex5的逆向转运提供另一个可能的途径。

综上所述，作者最后提出了过氧化物酶体蛋白输入过程中Pex5通过泛素连接酶复合物完成逆向转运的模型（图3）。首先，泛素连接酶复合物的跨膜结构域在膜内形成一个开放的通道。其次，在正常的输入循环过程中，Pex5在基质侧将其N端柔性区段插入中央通道中使其穿过并与RF2互作发生mono-ubiquitination，被修饰的Pex5会进入细胞质参加新一轮的蛋白转运循环。另一方面，当Pex5的mono-ubiquitination被阻断的情况下，不能通过RF2一侧输出，从而在水平方向上横向移动接近RF10并发生Poly-ubiquitination，帮助Pex5进入蛋白酶体进行降解。因此，Poly-ubiquitination途径可以作为mono-ubiquitination途径的后备应急机制，帮助不能正常循环转运的Pex5穿过膜，防止其造成中央通道的堵塞。

图3. Pex5通过泛素连接酶复合物逆向转运模式图

该研究的在细胞生物学领域的重要意义在于：

1. 首次发现了过氧化物酶体的泛素连接酶复合物可以形成蛋白通道逆向转运受体Pex5。

2. 提出并且证明了两条并行的Pex5 ubiquitination途径可以帮助Pex5完成逆向转运，其中mono-ubiquitination帮助Pex5循环，poly-ubiquitination作为后备机制帮助清除未能完成循环的Pex5，使其降解。

除此之外，该研究还为旨在治疗过氧化物酶体功能缺失疾病的群体和临床团队提供了很多新的线索和思路，尤其是为携带泛素连接复合物遗传突变的病人和家庭带来了希望。

哈佛医学院细胞生物学系Tom Rapoport教授为本文章的共同通讯作者，丰培强博士为第一作者兼共同通讯作者。该研究得到霍华德休斯医学研究所的资金支持。据悉对本研究做出重要贡献的吴旭冬博士即将入职西湖大学组建实验室，研究重要细胞器的稳态调控，互作，应激等重要分子通路，探索其在重大疾病中的生理意义。如有兴趣者，请访问https://xudongwu-lab.org/。

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04903-x

制版人：十一

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