鲤科鱼类两种膜型TLR5形成同源二聚体感知dsRNA

鱼类在复杂的水环境中生存，随时面临病原微生物的感染。先天性免疫反应快且作用广，鱼类主要通过模式识别受体感知病原微生物产生免疫应答反应，TLR是鱼类重要的模式识别受体家族之一。鱼类TLR信号通路与哺乳类既存在相似性又有差异性。鱼类出现特有的TLR种类，可能与其生活环境和自然选择压力相关，因此探索鱼类TLR在感知病原微生物等入侵机制，对脊椎动物先天性免疫演化以及哺乳动物免疫调控机制的认识均具有重要意义。

TLR5作为重要的先天性免疫识别受体而感知细菌鞭毛蛋白。恒温动物（哺乳类和鸟类）仅具有一个TLR5同源物形成同源二聚体监测鞭毛蛋白。而硬骨鱼类由于复制或重组而具有多种TLR5类型。鲤科鱼类斑马鱼和草鱼有两种膜型TLR5（TLR5a和TLR5b）。斑马鱼TLR5（DrTLR5a和DrTLR5b）形成异源二聚体感知鞭毛蛋白，然而缺乏DrTLR5a识别鞭毛蛋白的直接证据。但两个膜型TLR5能否识别其它配体，能否形成同源二聚体发挥生物学功能及其下游信号传递是否存在差异仍然未知。

近日，华中农业大学苏建国团队在EMBO Reports上发表了题为Cyprinid-specific duplicated membrane TLR5 senses dsRNA as functional homodimeric receptors的文章，报道了鲤科鱼类两种膜型TLR5形成同源二聚体感知dsRNA的机制，增加了对TLR激活机制的理解。

本研究发现草鱼TLR5（CiTLR5a和CiTLR5b）、DrTLR5a和DrTLR5b都能在体外结合鞭毛蛋白。鉴于TLR以二聚体形式发挥功能，本研究发现CiTLR5a和CiTLR5b通过形成异源二聚体感知鞭毛蛋白，CiTLR5a和CiTLR5b分别形成同源二聚体感知dsRNA。根据CiTLR5a、CiTLR5b过表达和干扰实验的结果，证明CiTLR5a在抗病毒反应中具有强有力的维持稳态作用。揭示了TLR5a与TLR5b可以形成同源二聚体来感知dsRNA，并产生相反的抗病毒反应。开启了一种新的机制，TLR5可以增加它们在病原体中监测微生物相关分子模式的能力。

这项研究揭示预测的poly(I:C)结合位点突变，CiTLR5a-G240A、CiTLR5b-N547A与poly(I:C)的结合能力均减弱。CiTLR5a-G240A增加了IFN1启动子活性，而CiTLR5b-N547A在poly(I:C)刺激后对IFN1启动子活性降低。然而，CiTLR5a和CiTLR5b结合poly(I:C)关键位点对应的DrTLR5a-G238A和DrTLR5b-N547A突变体不会减少与poly(I:C)结合，表明TLR5a、TLR5b具有序列特异性和物种特异性。N-糖基化修饰对膜蛋白折叠、稳定性和其他细胞功能至关重要。CiTLR5a和CiTLR5b的N-糖基化修饰显著影响其分子量和功能。蛋白免疫印迹显示野生型CiTLR5a（11个潜在的N-糖基化位点）的分子量大于野生型CiTLR5b（7个潜在的N-糖基化位点），且两者均大于其理论分子量。经糖苷内切酶处理后，CiTLR5a与CiTLR5b蛋白大小恢复到理论值。特定的N-糖基化位点突变（CiTLR5a-T101，对应的CiTLR5b-I99）可以导致IFN信号功能的转换，但不影响配体结合（鞭毛蛋白和poly(I:C)）。N-糖基化位点CiTLR5a-T101和相应的CiTLR5b-I99在抗病毒反应中具有“开关”作用。这些结果表明关键的N-糖基化修饰在CiTLR5a与CiTLR5b中具有重要的免疫调节功能。

图1 TLR5在不同物种中的分布

TLR5在演化过程中经历了原始M型（雀鳝）、复制M型（鲤科鱼类M/M型）、过渡M型（斑点叉尾鮰M/M/S型）、协同M型（虹鳟、非洲爪蛙和安乐蜥M/S）和普通M型（恒温动物）（图1）。鲤科鱼类特异性TLR5（M/M型）表现出的新功能，可以形成同源二聚体感知病毒dsRNA并具有拮抗作用，两种膜型TLR5以异源二聚体感知细菌鞭毛蛋白（图2）。在配体结合方面，CiTLR5a、CiTLR5b同源二聚体均可以在酸性和中性条件下结合dsRNA和鞭毛蛋白。在酸性早期内体和溶酶体中，同源二聚体感知dsRNA，异源二聚体感知鞭毛蛋白进而产生免疫应答反应。从结构上看，CiTLR5a、CiTLR5b具有保守的鞭毛蛋白结合区域和位点，容易通过同源二聚体或异源二聚体结合鞭毛蛋白，但只有异源二聚体感知鞭毛蛋白激活免疫应答反应。dsRNA与CiTLR5a胞外结构域的前中部结合，而与CiTLR5b胞外结构域的末端结合，因此它们仅通过同源二聚体与dsRNA结合，将dsRNA钳住进而触发免疫应答反应。CiTLR5a具有轻微的负调控作用和强大的维持稳态作用，而CiTLR5b在抗病毒反应中发挥强有力的正调控作用，其主要由一个关键的N-糖基化位点（CiTLR5a-T101，对应的CiTLR5b-I99）和一个关键的poly(I:C)结合位点（CiTLR5a-G240, CiTLR5b-N547）控制。这些发现揭示鲤科鱼类TLR5参与抗病毒和抗细菌的免疫应答反应，增加了对TLR激活机制的理解，为重复基因的新功能化开拓了思路。

图2 CiTLR5a和CiTLR5b配体识别及其调控模型。

华中农业大学苏建国教授为本文的通讯作者，课题组博士研究生廖志伟为文章第一作者。华中农业大学杨春荣老师，博士研究生蒋锐，朱文涛参与部分研究工作，本项目研究也获得华中农业大学张永安教授的大力支持和指导。该团队从2006年开始，长期围绕鲤科鱼类TLR模式识别受体家族开展研究，相关研究成果发表于EMBO Reports、The Journal of Immunology等刊物。

https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202154281

制版人：十一

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