David Liu：基因编辑疗法体内递送的3大核心技术 | Cell重磅综述

基因编辑疗法具有治愈遗传疾病的潜力，但需要能够安全有效地将基因编辑药物递送至体内相应的靶器官和组织。近日，David Liu及其合作者在Cell杂志发表最新综述文章，详细总结了用于递送体内基因编辑药物的载体平台（病毒载体、脂质纳米颗粒、病毒样颗粒），并比较了每种方法的优缺点，以及未来的改进方向。

来源：Cell

基因编辑药物可通过DNA、mRNA、蛋白质或者核糖核蛋白（RNP）的形式存在。将这类大分子药物成功地递送到细胞内需要突破多个生理屏障：（1）在药物进入细胞之前，需避免药物与载体解离或药物降解；（2）靶向特定细胞；（3）穿过细胞膜进入细胞内部：（4）在特定的细胞器中释放药物。

基因编辑药物体内高效递送载体的要求（来源：Cell）

绝大多数基因编辑药物载体将药物封装在蛋白或脂质壳中，可稳定药物在循环系统或者给药位点的结构，直至药物达到靶细胞。此外，运输载体需要避免被免疫系统识别，防止免疫系统激活后的靶向降解。例如，载体的某些组分可能激活补体系统，导致由吞噬免疫细胞的清除；抗体识别递送载体也会导致非预期的吞噬清除。

将药物递送到靶细胞内部首先需要递送载体结合这些细胞，这一过程高度依赖给药途径。静脉注射递药载体可以实现高效的肝脏靶向，但由于存在某些生理屏障（如血脑屏障），载体进入中枢神经系统（CNS）等组织非常困难。通过鞘内注射或者眼内注射（如视网膜下注射）可以绕过一些生理屏障，实现CNS或眼细胞靶向。但是，载体接近特定类型的细胞并不能保证与这类细胞结合，此时可以在载体表面嵌合特异性的靶向基团，通过识别靶细胞表面的受体促进载体与靶细胞的结合与内吞。

载体与靶细胞结合后，递药平台还需要穿过细胞膜进入细胞。许多情况下，载体与细胞表面受体结合后可激活细胞的内吞作用，载体通过内涵体进入细胞。但是，如果载体长时间停留在内涵体中，载体与药物一道将被降解。因此，载体必须实现内涵体逃逸，在内涵体外部将药物释放到细胞质中。很多载体都是利用内涵体的酸性环境触发载体结构变化从而实现上述过程的。总的来说，一种高效的递送载体必须在细胞外具有足够的稳定性保护药物结构，而在内涵体中可迅速解聚、释放药物。

几十年来，研究人员开发了几种可以突破各类生理屏障的递送载体，目前研究最为充分的包括病毒载体、脂质纳米颗粒和病毒样颗粒。

病毒载体

经过长期进化的病毒可以有效克服体内多种生理屏障，是将核酸药物递送到特定类型细胞的理想载体。目前，许多病毒载体已用于基因编辑药物的递送，应用于超过1000项临床试验中。绝大多数的基因编辑药物都采用腺相关病毒（AAV）为递送载体，少部分临床前试验中使用了慢病毒或腺病毒为递送载体。

腺相关病毒递送载体

AAV是一种直径为25 nm的无包膜病毒，由病毒蛋白VP1、VP2、VP3组成二十面体衣壳，装载大小约为5 kb的DNA基因组。目前，AAV已用于动物模型、临床试验和FDA批准的基因疗法中，是目前最常用的递送大分子药物的载体之一。

作为递送载体的AAV具有许多独特的优势：（1）AAV具有良好的安全性与生物相容性，（2）可将药物递送至眼、肝脏、脑部、心肌、骨骼肌等组织，自然产生与实验室合成的不同类型AAV衣壳血清型可实现不同的组织靶向性。

AAV的缺点主要是装载能力有限（仅为5 kb的DNA）。AAV载体基因组两侧必须含有2个反向末端重复序列（ITR），以实现AAV生产过程中包装载体基因组。因此留给转基因盒的实际空间仅为4.7 kb。例如，绝大多数使用canonical S. pyogenes Cas9（SpCas9）靶向域的碱基编辑器（BE）和先导编辑器（PE）体积往往太大，无法塞入单个AAV载体中。此外，转基因盒中除了需要发挥基因编辑作用的DNA和某些情况下必须的向导RNA外，还需要含有启动子和顺式作用元件才能实现体内活性。这些额外的组分进一步限制了单个AAV的装载能力。为了克服这种限制，研究人员开发了一系列方法。

• 有效重组全长蛋白的双AAV策略研究进展

将基因编辑药物分成两部分，每部分以一个AAV单独封、同时给药，在细胞内递送两段基因编辑药物的AAV共转染，在DNA、前体mRNA或蛋白水平重组为全长基因编辑药物。

其中，mRNA和蛋白质反式剪接策略已应用于重组全长基因编辑药物。例如，多个实验室已经成功开发了由蛋白质内含肽介导的蛋白反式剪接重组策略。在这些应用中，断裂成两段的基因编辑药物每段都要与蛋白质内含肽融合后再分别封装到独立的AAV衣壳中。共转染的细胞中，两段基因编辑蛋白分别表达，在蛋白质内含肽二聚化的帮助下实现反向剪接，重构全长蛋白。

蛋白质内含肽介导的蛋白质反向剪接方法的碱基编辑效率是mRNA反式剪接策略的4.5倍。这种差异可能来源于mRNA剪接过程共需要2步，包括AAV基因组拼接，随后是ITR序列的转录与剪接，这会破坏前体mRNA的稳定性。因此，蛋白质内含肽介导的蛋白质重构策略更具实用性。

• 单个AAV载体递送基因体积较小的Cas同源物相关研究进展

单一AAV递送载体具有双AAV载体无可比拟的优势。一方面，单个AAV载体可以降低实现有效基因编辑水平的AAV给药剂量。另一方面，同时转染多个AAV较为困难，单个AAV策略可以提高基因编辑效率。此外，由于AAV可导致剂量限制性毒性，降低AAV剂量可以提高给药安全性。

鉴定Cas9小体积同源物，或者生成小体积工程化Cas9突变体使得以单个AAV递送CRISPR基因编辑药物成为可能。来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶（SaCas9）在单个AAV方法中常用，其尺寸仅为3.2 kb，可与1~2个向导RNA表达盒共封装于单个AAV中。最近又发现了一些其他的小体积Cas9突变体，如Nme2Cas9（3.24 kb）、CjCas9（2.95 kb）、SauriCas9（3.18 kb），这些新发现丰富了单个AAV载体可封装的Cas9酶工具箱，拓宽了单个AAV载体的靶向范围。

• 减少AAV递送后基因编辑药物的长期表达

由于AAV基因组主要游离于细胞核中，因此表达可长达数年， AAV递送的问题之一在于基因编辑药物在转染细胞中长时间表达。长时间的表达对基因增产疗法（gene augmentation therapy）可取，但由于存在各种脱靶问题，基因编辑药物的长时间的表达是不可接受的。此外，长期非人源Cas9表达将触发免疫反应，表达此类Cas9的细胞将被免疫系统攻击。为解决这一问题，开发了许多瞬时表达AAV递送的基因编辑药物的策略。

研究人员开发了自灭活CRISPR/Cas9 AAV系统。这种策略将片段插入/缺失多态（indel）引入AAV基因组中，基因编辑药物的表达将触发自灭活。尽管小鼠实验中，这种技术在未显著降低在靶编辑的前提下发挥了一定作用，但基因编辑药物的表达没有完全被阻断，此外还发现了AAV片段整合到目标基因组位点中，具有安全性风险。

Xon是一种采用小分子控制RNA选择性剪接来精密调控AAV转基因表达的方式。在小分子诱导剂存在的情况下，药物调节的剪接促使含有起始密码子的外显子形成完整的mRNA，表达全长蛋白；而没有小分子诱导剂，该外显子被排除在mRNA之外，基因编辑药物无法正常表达。

以上两种策略都是时间依赖性的，研发人员还开发了空间依赖的基因编辑药物表达控制策略。研究人员使用了组织特异性的AAV衣壳、启动子或miRNA，基因编辑药物的表达被局限在特定组织中，最大限度减小了在非靶组织中的脱靶编辑。尽管自然产生或实验室来源的AAV衣壳拓展了AAV的递送范围，但是并不能保证AAV递送的特异性。利用组织特异性的启动子驱动基因编辑药物表达是一种很有吸引力的策略，但受封装尺寸影响，启动子的选择余地不大。在Cas9表达盒的3’UTR区中加入将内源性miRNA结合位点是调控基因编辑药物表达的有效策略。Cas9蛋白表达仅限miRNA低表达的组织，在高表达miRNA的组织中该蛋白将被沉默。

慢病毒递送载体

慢病毒（LV）是一种源自HIV-1的包膜病毒，由于3’LTR缺失，病毒生成关键成分断裂而不具复制能力。经LV递送的RNA药物在细胞内逆转录，稳定地半随机整合到转染细胞的基因组中。目前，已经开发出整合酶缺陷慢病毒载体（IDLV），由于整合酶结构域失活，病毒cDNA在反转录后游离。LV主要用于离体基因编辑，包括造血干细胞（HSC）和T细胞基因递送。目前FDA批准的两款CAR-T疗法即采用这种方法。

LV的诸多优点使其在基因编辑领域具有独特的优势。首先，LV可容纳高达10 kb的DNA药物，足以将已知的基因编辑药物装入单个载体中，尤其适用于采用CRISPR技术对多个基因组编辑（需要多个sgRNA表达盒）。其次，LV可同时在分裂细胞和非分裂细胞中转染。此外，IDLV基因组还可用作同源性介导修复（HDR）模板。最后，慢病毒的亲嗜性（tropism）可通过改变病毒粒子的包膜糖蛋白调控。

以LV实现体内基因编辑的案例较少。Palczewski等将编码ABE和向导RNA的LV通过视网膜下注射到小鼠体内，以纠正利伯先天性黑矇小鼠模型中RPE65基因的一个过早终止密码子。单剂量LV注射在目标部位实现了15%的碱基编辑，小鼠视力水平接近正常。这项研究是一个基因增产疗法（而不是基因编辑疗法），但已充分说明LV的有效性。

LV体内递送的缺点也很明显，即潜在的基因组整合。尽管IDLV载体可实现病毒cDNA游离，但仍有基因组整合的可能性，进而导致基因编辑药物长时间表达，增加了脱靶编辑的风险。需要注意的是，在体内基因增产疗法的临床研究中使用LV为载体引发公众对遗传毒性、免疫原性、制造成本的担忧，这些因素将来可能限制LV的实际应用。

腺病毒递送

腺病毒（Ad）是一种二十面体的无包膜病毒，大小约为90-100 nm，基因组较大（36 kb）。以Ad运送DNA类药物，转染细胞中DNA表型将长期维持。Ad是目前基因疗法临床试验中最常用的病毒载体（占比超过20%），主要是由于载样量高、生物学明确、遗传稳定性好、转染效率高以及生产工艺成熟。此外，Ad已有57种可感染人类的血清型和约100种可感染灵长类动物的血清型，研究人员可以利用不同的衣壳调节Ad的趋向性。以Ad递送系统的确可以实现有效的基因编辑，但也可能产生抗Cas9抗体，这可能是由于载体免疫原性导致的。

病毒载体的对比与总结（来源：Cell）

病毒载体的未来发展

总结而言，目前临床与临床前研究中病毒载体在递送基因编辑药物上展示了巨大的前景。由于体内病毒载体在多种细胞类型中强大的转染效率和药物递送能力，目前已在多种器官中观察到较高的基因编辑效率。未来病毒载体的发展趋势将沿着克服自身缺点进行，包括载体的免疫原性、基因编辑药物的长期表达、非靶标基因编辑、基因组整合的可能、制造成本和剂量限制性毒性。提高载体靶向的特异性可以降低给药剂量和制造成本，同时提高给药的安全性。

脂质纳米颗粒

脂质纳米颗粒（LNP）是体内基因编辑药物最重要的非病毒载体之一。几十年来，LNP在递送siRNA和治疗性mRNA领域取得了一系列突破。为了有效地将药物递送至靶细胞，LNP需要通过内吞作用进入细胞，在内涵体酸性条件下释放药物实现逃逸，并进入细胞浆。

LNP通常由可电离脂质或阳离子类脂质化合物、辅助脂质、胆固醇、保护剂聚乙二醇-脂质共轭物组成。不同组成的LNP可以实现不同的性质，包括药代动力学、细胞靶向性等。目前，LNP已被FDA批准用于静脉注射肝靶向的治疗性siRNA，以及肌内给药用于递送mRNA疫苗。

肝靶向LNP

大多数静脉注射的纳米颗粒将在肝脏中蓄积。LNP在血液中被ApoE载脂蛋白包裹，随后通过ApoE：LDL受体相互作用被肝细胞摄取。因此，LNP主要被用于肝靶向。

LNP最初是为递送siRNA开发设计的，但LNP发展的关键节点是在递送mRNA研究过程中发生的。Anderson在优化一种递送mRNA的脂质配方，希望这种制剂可以将SpCas9核酸酶mRNA递送到小鼠肝脏。这种SpCas9 mRNA以假尿苷和5-甲基胞苷修饰，有效提高了mRNA的稳定性，降低了免疫原性。最初仅有SpCas9 mRNA是以LNP递送的，而sgRNA表达盒、HDR供体DNA模板是以AAV8载体与上述LNP一同递送。这种方式导致小鼠肝脏中酪氨酸败血症突变24%的indel和0.8%的纠正，足以治愈疾病。随后，该研究团队通过研究表明，当这些sgRNA以2’OMe、2’F和硫代磷酸酯修饰时，封装在LNP中的sgRNA可以帮助实现更强的基因编辑效率。小鼠模型中，静脉注射同时封装SpCas9 mRNA和经化学修饰的靶向Pcsk9的sgRNA导致高达80%的基因编辑，血清Pcsk9水平降低到检测限以下。

非肝靶向LNP

由于大多数静脉注射的LNP在肝脏中蓄积，以LNP靶向非肝脏组织实现基因编辑具有一定的挑战性。一种方式是通过局部注射，此前多个实验室报道，局部注射脂质包裹的RNP后，成功地在小鼠内耳和视网膜中实现核酸酶编辑和碱基编辑。但是，发展全身给药的LNP载体递送基因编辑药物实现非肝脏靶向将大大扩展LNP载体的应用范围。

Siegwart等人通过加入一种带电脂质组分，调节了纳米粒子的内部电荷，而没有对LNP的标准组分造成显著干扰，从而开发出选择性器官靶向（SORT）LNP。研究发现，改变额外添加组分的电荷和浓度可以实现LNP的肺或脾脏靶向。这种SORT LNP可将Cas9 mRNA和sgRNA特异性递送至肺组织，实现15%肺组织的基因编辑。需要注意的是，尽管调节LNP组分可以赋予其不同的靶向能力，但是这种特异性的具体机理仍未明确。

另一种实现非肝脏靶向的策略是将靶向基团（如抗体片段）结合到LNP表面。例如，Epstein最近的一项研究中报道了将抗CD5抗体结合到LNP靶向，静脉给药后可以靶向T细胞，瞬时产生治疗小鼠心脏损伤的CAR-T细胞。这种主动靶向尚未在人体中实现基因编辑药物靶向至非肝脏组织，上述研究成果作为一种概念验证，证明了LNP非肝脏靶向的潜力。‘

LNP的未来发展

相对于病毒载体，LNP递送在递送基因编辑药物领域具有几项优势。LNP递送基因编辑药物可实现瞬时表达，相对于病毒载体带来的基因编辑药物长时间表达，LNP可以最大程度地减小脱靶效应的可能；基因编辑药物长时间表达可能导致转染细胞被免疫系统攻击，影响转染细胞长期发挥作用。此外，LNP的免疫原性远低于病毒载体，某些情况下可以重复给药，具有良好的安全性和生物相容性，可以递送满足有效基因编辑水平的药物剂量。最重要的是，目前LNP的大规模生产工艺已经成熟，这为使用LNP递送体内基因编辑药物的临床试验提供了基础。

开发非肝脏靶向的LNP载体仍是目前的研发重点。深入理解LNP配方和组织靶向性将赋予LNP新的特异性。目前学界高度关注的细胞类型包括了造血干细胞，LNP可以通过静脉或骨内注射，将基因编辑药物递送至骨髓造血干细胞。由于无需采集患者造血干细胞体外编辑后移植的过程，这将彻底革新遗传性血液疾病的治疗模式。总的来说，考虑到LNP在递送多种RNA药物取得的成功，LNP未来将广泛地应用于肝脏和其他脏器的体内基因编辑。

病毒样颗粒递送系统

病毒样颗粒（VLP）具有递送基因编辑药物的潜力。VLP由不具感染性的病毒蛋白组成，可用于递送mRNA、蛋白或RNP。VLP来源于病毒支架，可利用病毒特性实现有效的细胞内递送，具有封装药物、内涵体逃逸的功能，经设计可靶向不同的细胞类型。但不同于病毒载体以DNA为基因编辑药物，VLP是以mRNA和蛋白质瞬时递送基因编辑药物，降低了脱靶基因编辑和病毒基因组整合的风险。基于上述原因，VLP递送基因编辑药物很有潜力。

几乎所有报道的用于递送mRNA或蛋白药物的VLP都是基于逆转录病毒，这种病毒非常适合作为VLP。首先，未成熟的逆转录病毒颗粒呈球形，缺乏刚性对称结构。与大多数无包膜二十面体病毒载体相比，这种形式的递送平台可以提高封装药物的灵活性。此外，逆转录病毒直径（100-200 nm）大，可以提供充足的空间用于装载药物。最后，逆转录病毒可实现模块化设计实现细胞靶向和药物装载功能。细胞靶向性可由包膜糖蛋白调控，而药物装载受衣壳蛋白控制，各类衣壳结构可以轻松地与包膜糖蛋白组装。

递送mRNA的VLP

VLP包装mRNA药物需要独特的分子机制。基于该机制，特定的mRNA可被病毒衣壳蛋白识别，随后掺入病毒粒子中。逆转录病毒RNA基因组包含一个包装信号（Ψ），这种信号可以指导病毒RNA封装到病毒颗粒中。因此，经工程改造含有Ψ的mRNA可类似地掺入病毒粒子中。Baum等人开发的首款使用Ψ将Cre重组酶mRNA整合到小鼠白血病病毒（MLV）颗粒中。这种含有Ψ的mRNA经过额外的修饰，确保不会被MLV逆转录酶作用形成病毒cDNA并整合到转染细胞的基因组中。然而，每个病毒颗粒只能装载2个含有Ψ RNA拷贝，这一特性促使科学家开发更多的VLP递送策略。

Pagès等人利用MS2衣壳蛋白（MS2cp）和MS2适配体（MS2apt）间的相互作用，直接将mRNA药物包装到修饰过的HIV-1颗粒中。研究人员以MS2cp替换了HIV-1核衣壳中的ZF2结构域，在荧光素酶mRNA药物的3’末端引入12个MS2apt拷贝。这种递送载体中每个VLP可以封装5-6个拷贝的荧光素酶mRNA，这种方式进一步改进了Ψ介导的RNA包装。因此，通过修饰逆转录病毒衣壳蛋白引入MS2cp，同时在mRNA药物中引入MS2apt同样是一种以VLP包装VLP的有效方法。

VLP递送策略（来源：Cell）

以VLP包装mRNA用于递送基于Cas9的基因编辑药物的缺点之一在于各类与向导RNA相关的递送挑战。未经化学修饰的向导RNA会被快速降解，除非与Cas9蛋白形成复合物。因此，将指导RNA与Cas9 mRNA共同包装在VLP中，向导RNA可能在转染细胞合成Cas9蛋白之前被大量降解。

包装蛋白或RNP的VLP

以VLP封装目标蛋白或RNP药物需要在VLP形成时将靶蛋白定位到VLP中。为实现上述过程，研究人员将药物蛋白与病毒结构蛋白（包括在逆转录病毒gag多聚蛋白的不同位点）融合。这种策略可在衣壳自组装过程中将药物导向病毒粒子。大多数情况下，gag和药物蛋白通过一个短肽序列连接，在病毒粒子成熟（即药物成功封装）后，该序列被共封装的病毒蛋白酶切割，药物可以释放到转染细胞中。目前，这种方法应用于多种VLP封装和递送的蛋白质药物。

有研究团队开发了将Cas9蛋白封装到VLP中，但不涉及gag-Cas9融合的策略。Indikova等将Cas9与HIV-1 VPR（一种通过与HIV-1 gag p6域相互作用封装到HIV-1颗粒中的辅助蛋白）的C末端融合。这种VLP在HEK293T细胞中的编辑效果高达90%，但在原代人类T细胞中的编辑效率仅为15%，低于Doudna课题组开发的HIV-1 gag融合Cas9 VLP。Lu等人利用适配体和适配体结合蛋白相互作用，以Cas9 mRNA取代Cas9 RNP封装在VLP中。他们以com适配体取代向导RNA的四核苷酸环，将HIV-1核衣壳ZF2结构域下游直接融合了com适配体结合蛋白，并在VLP生产细胞中表达这种结构。通过这种方法，RNP包装由向导RNA:VLP衣壳相互作用驱动，该过程需要Cas9蛋白与含有适配体的向导RNA形成复合物，然后再将RNP加载到颗粒中。

VLP未来展望

使用VLP递送基因编辑药物的主要优势是降低脱靶编辑风险。大量研究表明。相对于质粒和病毒载体，VLP可有效减少体外脱靶编辑事件。最近的研究研究表明VLP在体内也可提供最小的脱靶编辑可能。考虑到最新一代递送RNP的VLP对比递送mRNA药物的VLP或LNP具有相当的在靶编辑效率，以及这种方法的脱靶编辑风险很小，预计递送RNP的VLP载体将在许多应用场景中成为首选方法。

VLP的细胞靶向性可通过不同的包膜糖蛋白调节。为了拓宽VLP递送范围，需要证明VLP靶向其他器官的能力，这需要通过不同的包膜糖蛋白或其他靶头实现，以实现VLP融合病毒递送可编程靶向性、mRNA和RNP瞬时递送的优势。

尽管目前eVLP在小鼠模型中全身给药无毒，eVLP的体内安全性还需进一步评估。上述所有VLP均来自病毒支架，VLP的免疫原性也需重点评估。最近，Zhang等报告称哺乳动物逆转录病毒样蛋白PEG10可以被编程来包装包括Cas9核酸酶在内的mRNA药物。由于PEG10是一种内源性哺乳动物支架蛋白，它可以避免由逆转录病毒引发的潜在免疫原性。

未来展望

目前，基因编辑药物可以轻松地通过静脉注射进入肝细胞、通过眼内注射靶向眼睛细胞。因此在不久的可以真正用于人体的基因编辑药物很有可能出现在这两个领域。但是，通过静脉注射靶向非肝组织仍是基因编辑药物递送载体的最大挑战。具有不同衣壳的天然或人工合成的AAV载体可以靶向中枢神经系统、骨骼肌、心肌等非肝组织；VLP也有相似的性质，配以不同的包膜糖蛋白可靶向不同的细胞类型。实现特定类型的细胞靶向非常重要，一方面可以实现基因编辑药物的减毒增效，另外一方面必须避免靶向人体生殖细胞，否则将带来严重的伦理问题。

由基因编辑药物的体内递送导致的免疫原性问题非常复杂。机体中预先存在的抗递送载体抗体将直接中和载体而干扰基因编辑疗效的效果；体内对Cas9蛋白或基因编辑药物中其他成分预先存在的抗体将导致免疫系统清除转染细胞。同时，基因编辑药物在编辑细胞内长时间表达也将激活适应性免疫反应，导致转染细胞被清除。因此，机体没有预存免疫的情况下，单次瞬时给药是有效的，但这可能触发适应性免疫，从而限制重复性给药。

基因编辑药物瞬时递送的另一个优势在于降低脱靶编辑的可能。降低体内脱靶基因编辑发生率非常重要，因为此类脱靶编辑可能导致严重的致癌突变。尽管病毒载体往往导致较长的基因表达，开发在实现靶向编辑后关闭基因编辑药物表达的策略对减少脱靶编辑是有益的。以LNP递送mRNA药物可实现瞬时基因编辑，获得理想的在靶/脱靶性质特征；而递送RNP降低了基因编辑药物暴露时间，最大限度减小脱靶编辑的可能。目前有效递送RNP的方式仅限eVLP，但出于其优秀的安全性，未来改进后的RNP递送载体可能会有更重要的作用。

总结而言，随着越来越多基因编辑药物进入临床，可靠的体内递送技术的可获得性越来越重要。未来递送技术的发展也将助力基因编辑疗法和其他大分子疗法的进步。

备注：封面图来自Casey Atkins Photography, courtesy of Broad Institute。

参考资料：

[1]Aditya Raguram et al. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell. 2022.