经典复方思路学习一波:结合血清化学、代谢组学、网络药理学揭示当归芍药散治疗原发性痛经的物质基础及作用机制

导读

当归芍药散（DSS）是著名的方剂，已在中国成功用于治疗原发性痛经（PD）。但是，它的物质基础和作用机制仍未被揭示。本研究旨在通过血清药物化学、代谢组学和网络药理学的综合方法，揭示DSS治疗PD的物质基础和作用机制。结果表明，DSS显著缓解了PD的生理和病理症状，改善了扭体行为、抑制了子宫水肿、恢复了临床生化指标和代谢特征。此外，代谢组学分析表明，DSS的治疗效果归因于花生四烯酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及苯丙氨酸代谢的调节。同时，口服DSS后鉴定出23种血液成分。通过分析鉴定出的生物标志物与血液成分的相关系数，我们提取出与关键代谢途径密切相关的活性化合物，并以这些活性化合物为基础进行网络药理学预测分析。研究发现，DSS的活性成分包括泽泻醇B，23-乙酸酯、绿原酸、欧当归内酯A、西阿尼醇、洋川芎内酯A、白术内酯II、新蛇床内酯，与类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路等密切相关。与花生四烯酸代谢相关的PTGS2和PTGS1可能是DSS的关键靶点。本研究证明，将血清药物化学、代谢组学和网络药理学相结合，是研究DSS的物质基础和分子机制的有力途径，为DSS的应用提供了坚实的基础。

论文ID

原名：Integrated Serum Pharmacochemistry, Metabolomics, and Network Pharmacology to Reveal the Material Basis and Mechanism of Danggui Shaoyao San in the Treatment of Primary Dysmenorrhea ‍

译名：结合血清药物化学、代谢组学、网络药理学揭示当归芍药散治疗原发性痛经的物质基础及作用机制

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF：5.988

发表时间：2022.07

通讯作者：赵春颖 & 熊辉

通讯作者单位：承德医学院河北省中药研究与开发实验室

实验设计

实验结果

1.一般特征、子宫指标和行为分析

体重、子宫指数和扭体反应的结果如图1所示。与空白对照(CON)组相比，各给药组和模型（MOD）组的体重增加缓慢，第5天明显下降（p < 0.01）。给药干预后，DSS组的体重减轻受到抑制 (p < 0.05) (图1A)。注射催产素后，MOD组的扭体次数和潜伏期显著增加（p < 0.01）。布洛芬或DSS处理后，各给药组大鼠的扭体次数显著减少（p < 0.05）（图1B，C）。与CON组相比，MOD组子宫指数明显升高（p<0.01）。治疗后各给药组均有一定的回调，差异有显著性（p < 0.05）（图1D）。这些结果不仅表明PD大鼠模型的建立成功，同时也提示DSS对PD具有治疗作用。

图1 基于一般特征、行为表现、生化水平和病理变化，探究DSS干预对PD的影响

(A)体重，(B)扭体次数，(C)扭体反应潜伏期，(D)子宫指数，(E)血清(E2、ET和Prog)和子宫(PGE2、PGF2α和β-EP)中的生化参数，(F)放大倍数×100的子宫组织病理学的代表性显微照片。数据表示为平均值±标准差；*p < 0.05，**p < 0.01 vs. CON组，# p < 0.05，和##p < 0.01 vs. MOD组。

2. 生化指标及组织病理学分析

与CON组相比，MOD组血清Prog水平显著降低（p < 0.05），E2和ET水平显著升高（p < 0.05）（图1E）。同时，大鼠子宫匀浆中PGF2α和PGE2水平显著升高（p < 0.05），β-EP水平显著降低（p < 0.05）。与MOD组相比，POS组和DSS组表现出一定的回调（p < 0.05）（图1E）。两个给药组之间未发现显著差异，说明DSS对PD有治疗作用，与阳性药物相当。病理结果显示，MOD组固有层出现大面积子宫内膜脱落及严重水肿，水肿区空泡较多，细胞质疏松，染色较浅。POS组和DSS组子宫内膜脱落较少，水肿较轻，水肿区空泡减少，细胞质相对致密（图1F）。

3.多变量数据分析

根据既往建立的UPLC-MS分析方法，我们收集第10天CON组、MOD组、POS组、DSS组大鼠的尿样数据。我们采用多变量数据分析得到PCA评分图，比较分析各组大鼠的代谢情况，如图2所示。造模第10天，CON组与MOD组明显分离，进一步证明大鼠模型复制成功。与MOD组相比，各给药组可将代谢曲线回调至接近正常组，远离MOD组。结果再次证明了DSS干预PD的有效性。

图2 Ezinfo 3.0软件生成的第10天各组尿液样本的3D PCA评分图

(A)负离子模式。(B)正离子模式。

4. 差异生物标志物和代谢途径鉴定

我们通过CON组和MOD组之间的OPLS-DA分析获得VIP图。我们采用t检验分析组间差异，选择VIP > 1和p < 0.05的离子作为候选变量。根据质谱裂解规律、HMDB、ChemSpider数据库和参考文献，我们准确收集和分析了候选变量在一定碰撞能量下的二级裂解信息。参考上述识别模型，我们鉴定了46个潜在生物标志物的化学结构，结果列于补充表S3中。此外，我们生成直方图（图 3A）以分析每组中已识别生物标志物的含量水平。我们发现在原发性痛经模型大鼠尿液中的46个生物标志物中，DSS对其中42个具有回调作用，其中12个具有统计学意义，包括3-吲哚硫酸盐、硫酸表睾酮、癸二酸、亚油酸、泛酸、马尿酸等。

为进一步分类与PD相关的代谢途径，我们将46个代谢生物标志物的名称、HMDB编码和分子式导入metaboanalyst 5.0软件，得到10条代谢途径，主要包括苯丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢、初级胆汁酸生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、泛酸和 CoA 生物合成、酪氨酸代谢、类固醇激素生物合成、抗坏血酸和糖醛酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及嘌呤代谢（图3B）。然后，为了对DSS的功效靶点进行分类，我们将回调的42个生物标志物导入metaboanalyst 5.0软件，获得8条代谢途径，主要包括戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢、甾体激素生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、抗坏血酸和醛糖酸代谢、嘌呤代谢（图 3C）。根据通路影响值大于0.05的筛选标准和文献报道，我们得到了花生四烯酸代谢、戊糖与葡萄糖醛酸相互转化、苯丙氨酸代谢3个与PD和药效密切相关的代谢通路。

图3 (A)生物标志物相对表达水平的直方图，(B)采用MetaboAnalyst 5.0进行PD发病机制相关的代谢途径分析(1.苯丙氨酸代谢，2.戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，3.花生四烯酸代谢，4.初级胆汁酸生物合成，5.泛酸和CoA生物合成，6.酪氨酸代谢，7. 类固醇激素生物合成，8.抗坏血酸和醛糖酸代谢，9.精氨酸和脯氨酸代谢，10.嘌呤代谢)，（C）采用MetaboAnalyst 5.0进行DSS疗效相关代谢途径分析（1.苯丙氨酸代谢，2.戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，3.花生四烯酸代谢，4.酪氨酸代谢，5.类固醇激素生物合成，6.泛酸和CoA生物合成，7.抗坏血酸和糖醛酸代谢，以及8.嘌呤代谢）。

5.吸收的成分分析

由于大鼠血液成分含量低，我们借助MarkerView 1.3.1软件对HMDB、Chemspider等成分数据库中的数据进行对齐、归一化和匹配。结合 Ezinfo 3.0 软件和之前确定的 DSS 化学成分，我们获得候选变量的趋势图以发现仅存在于DSS组中的离子，最后，我们鉴定出23种血液成分（图4A）。详细结果在补充表S4中提供。其中，泽泻醇B乙酸酯、茯苓酸A、泽泻醇F、泽泻醇C 23-乙酸酯和泽泻醇A被归类为三萜类化合物。欧当归内酯A、salcolide、Z-蒿本内酯和3-N-butyl-4,5-dihydrophthalide被归类为丁基苯酞类化合物。去氢土莫酸、4-Hydroxy-3-prenylbenzoic acid、阿魏酸和绿原酸被归类为有机酸。白术内酯III、洋川芎内酯I和格列风内酯被归类为内酯类。异丁基苯基酮、cianidanol、芍药内酯苷和芍药苷被归类为类黄酮。我们还观察到对Hydroquinones gentisic acid 5-O-glucoside、生物碱jasminoside B和多酚没食子酸乙酯。同时，10个来源于芍药，13个来源于当归，8个来源于白术，8个来源于茯苓，4个来源于泽泻和11个源于川穹（图 4B）。

图4 DSS吸收到血液中的成分分析

(A) MOD和DSS组候选变量的相对响应强度趋势图，(B)在ESI+和ESI-模式下从DSS吸收到血液中的成分的UPLC-MS色谱图和化学结构。

6. 物质基础鉴定

我们将每只大鼠血液成分和生物标志物的相对含量数据导入metaboanalyst 5.0平台的统计分析模块，相关系数（R）的绝对阈值设为0.7，即0.7 < R ≤ 1，被认为是高度相关的，并由此生成了相关热图（图5）。候选血液成分与生物标志物的极端相关性达到5个以上，可以作为物质基础。共有9个极相关的成分，包括茯苓酸A、洋川芎内酯I、泽泻醇B、23-乙酸酯、绿原酸、欧当归内酯A、cianidanol、洋川芎内酯A、白术内酯II和sedanolide，是潜在的物质基础。

图5基于metaboanalyst 5.0平台的DSS血清成分与PD潜在生物标志物的相关热图

根据血清成分和潜在生物标志物的相对水平绘制热图。

7. 物质基础潜在靶点预测

中医的血清药物化学理论认为，在口服中药后只有血液中的成分才有可能成为潜在的生物活性成分，为有效鉴定中药体内活性化合物提供了有力的手段。因此，我们从中药血清成分中筛选出与疾病内源性代谢最相关的9个成分作为后续网络药理分析的研究对象更有意义。为了确认这些成分的效果，我们将它们引入TCMSP以预测靶点。然后，我们使用genecards和OMIM数据库搜索PD相关靶点并获得交叉靶点。结果发现共有27个共同靶点，包括细胞色素P450 3A4（CYP3A4）、类固醇17-α-羟化酶/17,20裂解酶（CYP17A1）、肿瘤坏死因子（TNF）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α异构体（PIK3CA）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1）、芳香化酶（CYP19A1）等。通过共同靶点KEGG通路的富集分析（通过错误发现率< 0.05预测），这些潜在靶点被认为涉及40条途径，包括类固醇激素的生物合成、VEGF信号通路、雌激素信号通路、IL-17信号通路、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路、皮质醇合成与分泌、甲状腺激素信号通路等（图6；补充表S5）。整合代谢组学的代谢途径结果，值得注意的是，包括类固醇在内的两种常见途径与CYP3A4、CYP17A1、CYP19A1相关的激素生物合成和与PTGS1相关的花生四烯酸代谢，PTGS2与DSS的发病机制密切相关，这意味着泽泻醇B,23-乙酸酯、绿原酸、欧当归内酯A、cianidanol、洋川芎内酯A、白术内酯II、salcolide是DSS治疗PD的物质基础。

图6配方-潜在物质基础-潜在靶标相关通路连接图

线条粗细表示连接的程度

作为治疗PD的有效制剂，DSS的主要成分绿原酸、欧当归内酯A、洋川芎内酯A等在PD、子宫出血、炎症活动等方面均显示出良好的治疗效果。通过对体重、子宫器官指数、扭体行为的分析，DSS连续处理10天后，我们发现大鼠体重有一定程度的恢复，子宫指数、扭体潜伏期、扭体次数均有明显改善。生化指标结果显示，E2、ET、Prog、β-EP、PGF2α、PGE2等疼痛因子的表达水平在给药干预后具有不同程度的回调作用。此外，子宫形态学变化也表明DSS可以显著抑制PD大鼠的子宫内膜剥落和水肿。从代谢组学的角度，我们发现DSS通过调节花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，以及调节前列腺素G2、马尿酸、6-hydroxy-5-methoxyindoglucuronide等的代谢轨迹来发挥功效。这证实了DSS对PD的有效性。

PD的基本机制被认为与子宫内膜前列腺素(PGs)的分泌有关。前列腺素是一种不饱和脂肪酸，广泛存在于女性子宫内膜、卵泡等各种重要器官和组织中。前列腺素G2 (PGG2)由花生四烯酸通过环氧合酶的作用转化而成。PGG2的过表达会促进前列腺素E2（PGE2）和前列腺素F2α（PGF2α）的产生。PGE2和PGF2α的产生是前列腺素代谢的关键节点，参与了子宫平滑肌舒张收缩的调节。月经期间，PD患者的子宫内膜分泌大量PGs，明显高于正常女性。这主要是痛经患者经期前黄体酮分泌减少及花生四烯酸释放所致，在环氧合酶的作用下被氧化成 PGs。当前列腺素分泌过多时，会引起血管和子宫肌层的收缩，导致缺血和疼痛。此外，增加前列腺素水平也可以改善对周围神经痛的感知。本研究发现MOD大鼠PGG2含量高于CON大鼠，说明花生四烯酸代谢异常，促进子宫平滑肌收缩，最终导致痛经的发生。DSS可部分修复花生四烯酸代谢，表现为PGG2的抑制作用，可减少PGF2α的合成和PGE2的表达，从而缓解疼痛症状。

据报道，炎症反应和氧化应激是PD发病的关键机制。由于PD发作时流向子宫肌层的血流量减少，子宫收缩时会诱发缺血，从而引发活性氧自由基的积累，从而导致子宫内膜细胞功能的改变，子宫氧化应激损伤和炎症反应。苯丙氨酸代谢通常被认为与氧化应激和炎症反应有关，而马尿酸和苯乙醛是苯丙氨酸代谢的中间体。马尿酸在甘氨酸和苯甲酸的参与下转化为酰基甘氨酸。酰基甘氨酸的过量分泌诱导线粒体脂肪酸β氧化障碍进而参与炎症反应。此外，炎症发生时马尿酸的表达水平均有不同程度的升高。苯乙醛由苯丙酮酸代谢转化而来。苯乙醛含量的增加导致苯丙氨酸代谢异常。马尿酸和苯乙醛在体内的积累表明炎症干扰了苯丙氨酸的代谢。DSS灌胃后，大鼠尿中马尿酸和苯乙醛含量降低，提示DSS可以通过调节DSS处理后的炎症反应和氧化应激来干预苯丙氨酸代谢，进而对痛经起到治疗作用。6-hydroxy-5-methoxyindole glucuroside是6-hydroxy-5-methoxyindole在肝脏中由尿苷二磷酸葡萄糖苷酶产生的代谢物。研究表明，戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化参与了PD的发病机制。6-羟基-5-甲氧基吲哚葡萄糖苷是戊糖和葡萄糖醛酸相互转化的中间产物，其异常表达可能参与PD的发病机制。马尿酸和6-羟基-5-甲氧基吲哚葡萄糖苷酸两种代谢物在建模过程中的异常表达表明，PD的发生发展都不同程度地伴随着戊糖与葡萄糖醛酸相互转化和苯丙氨酸代谢紊乱。DSS可以部分改善戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及苯丙氨酸代谢，这可以通过降低 6-羟基-5-甲氧基吲哚葡萄糖苷的水平来证明。

总体而言，本研究采用血清药物化学结合代谢组学技术探索DSS对PD相关生物标志物的影响，以揭示DSS的物质基础。此外，一般行为、组织病理学和生化特征证实了DSS的整体治疗效果以及PD和DSS之间的内在本质联系。最后，我们对物质基础的潜在靶点进行验证，以确保识别出的潜在物质基础与DSS的作用机制有关。这些发现鉴定出与花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等相关的46个生物标志物，并追溯了与DSS疗效相关的代谢途径。DSS的潜在物质基础包括通过血清药物化学和代谢组学相关分析提取的茯苓酸A、洋川芎内酯I、泽泻醇B,23-乙酸酯、绿原酸、欧当归内酯A、cianidanol、洋川芎内酯A、白术内酯II和sedanolide。以这些药效物质为研究对象，进一步网络药理预测显示，作用的潜在靶点主要涉及类固醇激素生物合成、VEGF信号通路、雌激素信号通路、IL-17信号通路、花生四烯酸代谢、鞘脂信号通路、皮质醇合成与分泌、甲状腺激素信号通路等。与花生四烯酸代谢相关的PTGS2和PTGS1可能是DSS的关键靶点，因为它们出现在代谢组学和网络药理学中。在此基础上，共有7个与多个关键靶点密切相关的化合物，如泽泻醇B,23-乙酸酯、绿原酸、欧当归内酯A、cianidanol、洋川芎内酯A、白术内酯II、salcolide，被认为是DSS治疗PD的物质基础。当然，这些化合物的相关代谢途径还需要深入跟进，进行点对点验证。代谢组学、血清药物化学和网络药理学可以展示一种有效的方法来研究和筛选中药潜在的有效化合物和作用机制。

结论

在本研究中，我们提出了一种基于血清药物化学、代谢组学和网络药理学的综合策略，以揭示DSS改善PD的物质基础和机制。结果共阐明了与10条代谢途径相关的46种潜在生物标志物，鉴定了口服DSS后的23种血液成分。我们进一步对血清药物化学和代谢组学进行相关性分析发现，共有9个极其相关的成分是潜在的物质基础。结合基于这些潜在物质基础的网络药理学预测，与花生四烯酸代谢相关的PTGS2和PTGS1可能是DSS的关键靶点。同时，我们已经确定了与多个关键靶点相关的7种化合物，如泽泻醇B,23-乙酸酯、绿原酸、欧当归内酯A、儿茶素、洋川穹内酯A、白术内酯II、新蛇床内酯，作为DSS治疗PD的物质基础。这些结果表明，血清药物化学、代谢组学和网络药理学策略为探索中药的物质基础和潜在机制提供了有力的途径

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35899122/

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