石正丽新作：冠状病毒S蛋白的进化

关于沙贝病毒亚属成员SARS-CoV-2 S蛋白的进化一直是我们关注的热点话题，现在中国科学院武汉病毒研究所石正丽团队发现了不同冠状病毒S蛋白进化差异情况。相关研究以题为“The Glycan-Binding Trait of the Sarbecovirus Spike N-Terminal Domain Reveals an Evolutionary Footprint”发表在Journal of Virology杂志上。

MERS-CoV和传染性胃肠炎病毒（TGEV）等冠状病毒与细胞表面的聚糖结合对病毒入侵细胞或者病毒致病性有重要作用；本研究发现SARS-CoV-2与其他几种常见沙贝病毒S-NTD基因中也有一个非常保守的血凝素区域，但不同沙贝病毒S蛋白在体外表现出不同水平的聚糖结合；与某些冠状病毒（包括 MERS-CoV）不同，存在于人肺细胞Calu3表面的唾液酸可抑制SARS-CoV-2以及其他沙贝病毒的感染。简单来说就是，冠状病毒S蛋白结合聚糖特性是不同冠状病毒家族进化过程中保留下来的，但是这种相互作用在病毒感染的过程中发挥的功能可能会不一样。

该团队对几种常见沙贝病毒S-NTDs结合聚糖能力以及其生物学功能进行了探究，旨在阐明沙贝病毒S蛋白的功能进化过程。

文章根据沙贝病毒亚属几种病毒的S-NTD序列构建了系统发育树，发现其与RBD呈现一样的高度多样性，主要形成了5个分支，即这个结构区域也经常发生突变。研究团队根据序列信息表达并纯化了不同进化分支的9种S-NTDs代表蛋白，检测其对不同属源红细胞的凝集能力，即结合红细胞表面聚糖能力，结果发现，沙贝病毒S-NTDs对聚糖分子唾液酸和ABO血型抗原亲和性很低。（图1）

图1

为了进一步探究沙贝病毒S-NTDs是否会与其他的多糖结合，文章检测了其与牛颌下粘蛋白（含有聚糖分子，BSM）的亲和性，结果发现，不同种类的病毒S-NTDs对BSM有不一样的亲和力，以SARS-CoV-2为代表的位于分支1的病毒对BSM的亲和力远高于其他分支的病毒（图2左上）；为了探究BSM如何结合沙贝病毒S-NTDs，文章对BSM上的唾液酸分子以及乙酰化修饰进行了处理，以BCoV-HE0为阳性对照，结果发现，这种相互作用与BSM上有无唾液酸（图2右上）、唾液酸有无发生蛋白乙酰化修饰（图2第2列）均没有直接显著关系，穿山甲CoV-GD S-NTD除外；作者进一步探究沙贝病毒S-NTDs与BSM的结合是否会对病毒入侵细胞产生影响，结果表明，与BSM结合并不影响伪病毒和活病毒入侵细胞（图3）。总的来说，沙贝病毒S-NTDs并非通过唾液酸与BSM发生结合，这种相互作用也不会对病毒感染产生显著影响。

图2

文章进一步研究了沙贝病毒S-NTDs对病毒入侵细胞的影响。首先使用沙贝病毒易感细胞系Calu3来研究不同S-NTDs对其结合能力，结果观察到沙贝病毒S-NTDs可以剂量依赖性结合Calu3细胞（图4-A）；对结合效率的探究发现SARS-CoV-2和SARS-CoV-2相关冠状病毒的S-NTDs对Calu3细胞结合效率远高于SARS-CoV-1、SARS-CoV-1相关冠状病毒以及MERS-CoV（图4-B）；接着，文章将Calu3细胞与不同量的纯化的S-NTD蛋白在37℃下孵育2小时，用不同的伪病毒和活病毒分别感染细胞，发现病毒的感染性不受S-NTD作用的影响（图4-C-D）。总的来说，沙贝病毒S-NTDs可以结合Calu3细胞，SARS-CoV-2相关冠状病毒结合效率更加高，但是这种相互作用对病毒感染没有显著影响。

图4

最后，文章探究了细胞表面的唾液酸是否会对病毒入侵细胞产生影响。首先使用神经氨酸酶（NA）切除Calu3细胞表面的唾液酸，使用MERS-CoV作为阳性对照，用不同的沙贝病毒伪病毒和活病毒感染预处理后的Calu3细胞，检测其感染情况，结果发现，与空白组相比，唾液酸的去除显著增强了沙贝病毒伪病毒以及活病毒入侵细胞能力，即唾液酸可以抑制沙贝病毒感染。（图5）

图5

本文结论

1.沙贝病毒S-NTDs具有一个保守的聚糖结合区域，可以结合BSM以及Calu3细胞，这和其他冠状病毒结合聚糖特性相类似，这可能是冠状病毒进化过程中保留下来的一种性状；但是这种相互作用对沙贝病毒感染无显著作用，这可能是不同的病毒进化情况。

2.Calu3细胞表面的唾液酸可以抑制沙贝病毒的感染，这与其他冠状病毒（如MERS-Cov）不一样，这提示粘蛋白可能作为保护宿主的免疫屏障，这有可能是沙贝病毒和其他冠状病毒在分化过程中适应了不同的宿主、细胞类型、组织或者宿主进化的结果。

文章作者提出，聚糖结合可能是沙贝病毒进化史上的一个进化足迹，并且

SARS-CoV-2可能仍在适应人类；后续需要进一步确定沙贝病毒的S-NTD中的聚糖结合是否和其他病毒表型有关，例如抗原性变异、跨物种传播和病毒传染性，还需要确定这种糖结合功能是否具有组织或细胞特异性作用，是否是该病毒进化出来的以及不合成酯酶的冠状病毒（如沙贝病毒）如何平衡病毒粒子的附着和释放。本研究扩展了我们对不同沙贝病毒的S-NTD生物学功能的了解，对冠状病毒刺突蛋白进化史提供了新见解。