Carbohyd. Polym. | 不同碳位丁酰基取代丁酸莲子淀粉酯的性质研究

文章

概述

短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是肠道菌群发酵碳水化合物的最终产物，为肠道微生物和肠道细胞提供能量。它们的浓度和比例与肥胖、糖尿病和代谢综合征等疾病密切相关。丁酸（butyric acid，BA）是后肠上皮细胞的主要能量物质，在所有SCFAs中利用率最高，对人类健康至关重要。由微生物产生的高达95%的丁酸被结肠消耗。肠道中BA的水平与盲肠和结肠中丁酸细菌的类型和数量有关。肠道菌群由可进入大肠的可用碳水化合物的数量和结构调节。抗性淀粉（resistant starch，RS）不能在健康人体的小肠中消化和吸收；它在大肠中发酵或部分发酵和代谢，产生BA、乳酸和少量气体。

BA是一种挥发性四碳有机酸，具有令人不快的腐臭气味和较短的半衰期，通过外部来源摄入的BA不能到达大肠供身体和肠道菌群使用。低浓度BA（0.5~1.0 mmol/L）促进细胞增殖和生长，而高浓度BA（1.0 mmol/L）抑制细胞增殖和增长，并增加肠道通透性。肠道菌群通过发酵益生元产生的BA量通常不足以供人类使用。丁酸钠具有相对稳定的性质，但其流动性差，并有腐臭的奶酪气味。在体外发酵中，丁酰化玉米淀粉产生的BA浓度范围为480.85~786.09 μmol/L。因此，开发一种能够将BA靶向大肠而不被小肠直接消化和吸收的益生元产品非常重要。

淀粉是莲子汁加工的副产品。先前的研究表明， 莲子抗性淀粉可以调节肠道菌群产生SCFAs，特别是丁酸。莲子淀粉（lotus see d starch，LSB ） 是一种低GI淀粉食品，其 具有较高的直链淀粉含量（35%~45%）、糊化温度膨胀力和较快的回生。淀粉的性质可以通过一系列改性来定制，这可以拓宽其在益生元制备、功能薄膜和控制糖尿病食品中的应用前景。化学改性是基于无水葡萄糖单元（anhydrous glucose unit，AGU）的游离羟基和官能团的反应来生产淀粉衍生物。最常见的化学修饰方法之一是酰化。在存在少量碱的情况下，取代发生在三个活性羟基上，即C6、C2和C3，其中C6位置最容易发生取代。目前，酰化淀粉的研究已成为当前食品科学和现代营养学领域的研究热点。使用乙酸和醋酸酐作为淀粉酯化剂生产的淀粉乙酰化是食品工业中批准的添加剂，编号为E1420。在传统研究中，主要侧重于淀粉酯的整体取代度（degree of substitution，DS），关于C2、C3和C6的不同伯碳和仲碳位置上酰基的分布比例研究很少。此外，关于丁酰化淀粉的研究还没有得到深入的鉴定，关于AGU上C2、C3和C6处丁酰基团的分布和结构特征之间的相关性的深入研究也鲜有报道。基于此，重要的是确定丁酰基的分布，为酯化BA在胃肠道中的后续释放提供指导。

因此，福建农林大学 郑宝东教授和 曾红亮副教授等 研究的目的是利用水相法研究和比较不同DS下LSB的多尺度结构、理化性质 和消化率。 利用高分辨率 1 H NMR光谱定量研究了不同DS下仲醇和伯醇羟基位置的丁酰基分布，研究了不同羟基位置的丁酰基淀粉酯的多尺度结构和物理化学变化，旨在为设计用于食品工业应用的具有目标结构的丁酰化淀粉产品提供基础知识。

结果

与讨论

取代基团分布

以氢氧化钠为催化剂，淀粉和丁酸酐在水溶液中反应制备不同DS的LSB。淀粉的酰化是通过加成-消除机制实现的，淀粉的三个游离羟基具有不同的反应性质。图1显示了具有不同丁酸酐浓度的LSB的DS。通过顺序12.5%、25%、50%、100%、200%、400%和800%观察到，随着酸酐浓度的增加，丁酰淀粉的总DS从0.03增加到0.87（图1）。这是因为随着反应物浓度的增加，反应速率增加。然而，当丁酸酐浓度增加到400%时，DS趋于基本稳定。添加丁酸酐后DS的变化趋势表明，在添加低浓度酸酐时，酰基的数量不足以取代羟基。然而，在高浓度酸酐存在下，酰基足以取代羟基位置。由于淀粉和丁酸酐的酯化反应不是均相反应，一些葡萄糖单元可能根本不被酰酐使用，因此理论上DS的结果小于3.0。

图1 丁酰化LSB的取代度

丁酰基取代发生在莲子淀粉的3 个活性羟基上，分别是与C-2、C-3和C-6连接的第二、第三（仲醇羟基）和第六（伯醇羟基）位置（图2A）。如图2B所示，使用水性1H NMR测定LSB不同碳位处的丁基基团分布。从天然淀粉LSB-0的光谱来看，5.50、5.40和4.60 ppm处的特征峰分别归因于C2、C3和C6羟基质子，这与先前的研究结果一致。2.5 ppm处的峰值归因于DMSO的氢原子。当天然莲子淀粉与丁酸酐反应时，可在2.3~2.1 ppm左右观察到两个不同大小的丁酰峰，这在LSB-0上未观察到（未添加丁酸酐）。LSB的1H NMR证实了丁基质子的存在，这表明莲子淀粉和丁酸酐之间的酯化是成功的。

（A） 图1中不同碳位的取代示意图丁酰化淀粉；（B） 通过1H NMR研究了丁酰基在伯碳和仲碳位置上的分布。

图2 丁基基团在初级和次级碳位置上的分配比

表1显示了LSB在不同伯碳和仲碳位置的取代。随着反应的进行，丁酸酐的添加量从12.5%增加到800%，总丁酰含量相应地从0.02增加到1.10。滴定法和1H NMR是测定丁酰化淀粉中DS的常用方法，由表一可知，两种方法的总体DS趋势非常相似。无论丁酸酐的添加量多少，可以观察到C-6位的丁酰基取代与C2,3位的取代相当。通常，由于空间位阻，伯羟基（即6-OH）比仲羟基更具反应性。上述结果表明1H NMR方法与传统滴定方法相比具有准确性。

表1 不同取代度丁酰化莲子淀粉的结构参数

形态特征

LSB-0和其他样品的SEM图像如图3所示。LSB-O颗粒表面光滑，无裂纹和断裂，大部分为椭圆形，少数为圆形和不规则，这与之前的观察结果一致。酯化反应后，具有较低DS（0.03–0.18，B1–E1）的LSB的形状和尺寸没有显著变化。然而，LSB易于团聚，并出现一些碎片。由于化学改性过程造成的一些表面损伤，这种聚集在颗粒融合的乙酰化淀粉中已被观察到。当DS达到0.23时，如图3（F1-F3），淀粉酯颗粒表面出现裂纹和塌陷。上述结果表明，在酯化反应过程中，莲子淀粉的–OH基团发生了不同程度的取代。引入的丁酰基在一定程度上破坏了淀粉颗粒的形态，促进了酯化反应。随着丁酸酐含量的增加，扩散驱动力增大。但当丁酸酐浓度增加到一定程度时，扩散的驱动阻力也增加，因此反应只发生在表面上，没有穿透颗粒。当丁酸酐的加入量分别为淀粉的4倍和8倍时，最高DS为0.87。同时，淀粉酯的形态与其他组分的淀粉酯有显著差异，这可能是为了保持碱性反应条件，随着丁酸酐用量的增加，加入大量氢氧化钠以促进淀粉形状的变化。

图3未丁酸改性和丁酰化LSB在放大5 000倍、10 000倍、20 000倍时的SEM显微照片

红外光谱

随着丁酸酐添加量的增加，对应于不同的DS值，获得了LSB的FT-IR光谱。如图4A所示，LSB-0显示了多糖的特征谱带，即3 700和3 000 cm-1之间的宽条带为O–H拉伸。这是因为丁酰基和淀粉羟基的酯化反应，即莲子淀粉中的羟基被丁酰基取代，这削弱了淀粉分子在3 500 cm-1处的羟基特征峰。

如表2所示，随着DS的增加，LSB的DO呈上升趋势，而DD值呈下降趋势。结果与先前的报道一致，即酰化淀粉比天然淀粉具有更好的短程有序结构，1 047/1 022 cm-1处的丁酰化淀粉比例随着DS的增加而增加。

图4未丁酰化改性和丁酰化LSB的结构特性

表2不同取代度的丁酰化LSB的DSC热参数

XRD分析晶体结构特征

进行XRD测量以揭示LSB的类型和结晶度的变化。在15.0◦、17.0◦、18.0◦附近出现峰值，在23.0◦处出现小衍射峰，这是莲子淀粉典型的C型结晶图案的特征。低DS和中等DS的LSB在15.0◦、17.0◦、18.0◦和22.9◦处有较强的衍射峰，在约11.2◦处出现小肩峰（图4B），显示C型图案的特征，表明低取代程度酰化没有破坏天然淀粉晶体结构。

随着LSB的DS增加，相对结晶度也逐渐降低，范围从50.70%到10.06%，如表2所示。由于部分羟基被取代，酰化过程中分子间和分子内氢键的形成减少，导致淀粉结晶度降低。此时，从XRD和SEM测量获得的表征结果表明，衍生化开始/优选发生在颗粒的非晶态区域，然后进行到更多的晶态区域。

13C-CP/MAS核磁共振法测定有序结构

C1集中在约102、100和99.7ppm，表明莲子淀粉典型的C型多态性。使用13C CP-MAS NMR谱确认LSB。从图4C中可以看出，LSB的光谱显示了淀粉的典型共振，包括99–102 ppm范围内的C1信号、82 ppm（以无定形C4为中心）、72 ppm范围内高度重叠的C2、C3和C5，以及62 ppm范围内高重叠的C6信号。LSB的光谱显示出几个新的共振，包括一个以173 ppm为中心的峰值。这与之前的报告一致，即173 ppm的化学位移被分配给羰基碳区域的信号，表明淀粉葡萄糖单元中羟基被取代。

SEC-MALLS-RI测定分子质量

淀粉颗粒由直链淀粉和支链淀粉组成。采用凝胶渗透色谱法测定分子量可以显示淀粉分子中直链淀粉和支链淀粉含量的分布，同时为淀粉改性和理化性质的测定提供有力的依据。丁酰化反应后淀粉酯的平均分子量如图5所示。DS高的LSB在色谱图上具有更高的保留时间，表明分子量降低。如表1所示，改性后淀粉酯的平均分子量从9.2×106 Da下降到3.7×106 Da。平均分子量随DS的变化显著，分别为0.84和0.87。这与FESM的结果一致。

图5未丁酰化和丁酰化LSB的分子质量分布

热分析

使用DSC测量的LSB-0和其他具有不同DS值的LSB样品的热性能如图6和表2所示。随着DS的增加，LSB的最大糊化温度逐渐降低（图8）。表2显示，LSB的初始温度、峰值温度、终止温度和糊化焓ΔH均低于LSB-0，这与其他研究人员报告的丁酸化玉米淀粉的趋势一致。

图6未丁酸改性和丁酰化LSB的DSC曲线

RVA结果

淀粉改性的目的是改变糊状物的性质。表2给出了LSB-0和其他LSB样品的RVA黏度参数。与LSB-0相比，LSB样品中的黏度参数（如峰值黏度、谷值、最低黏度、回生和最终黏度）降低。DS超过0.8的LSB由于DS高而没有糊化。如图7所示，改性淀粉的峰值黏度显著低于LSB-O。丁酰化玉米淀粉也有类似的行为，这是由于淀粉在酰化反应中受阻的分子内和分子间相互作用。

图7未丁酰化改性和丁酰化LSB的RVA糊化曲线

体外消化率

LSB-0和其他LSB样品的RDS、SDS和RS含量如图8所示。它们之间的RDS和RS含量存在显著差异。LSB-0在前20 min显示出较高的水解速率。随着DS的增加，水解速率降低。120 min后，水解速率呈现缓慢增加的趋势，这与RS的定义一致。

图8（A） 水解速率；（B） 未丁酰化和丁酰化LSB的淀粉组分（RDS、SDS和RS）

采用水相方法制备具有不同DS的LSB。当丁酸酐添加浓度达到一定程度时，DS值达到稳定。丁酰基在C6位的取代与C2,3位的取代相当。淀粉的丁酰化使其表面粗糙，高程度丁酰化使天然莲子淀粉的晶型从C型改变为V型，相对结晶度随DS的增加而降低。随着DS的增加，C6位的峰强度显著降低。在丁酰化过程中，淀粉颗粒膨胀形成更大的聚集体。丁酰化过程降低了糊化温度，但使RS含量增加了53%。丁酰基残基在C2、C3和C6的取代位点对LSB的性质有显著影响。C6原子上取代的基团数量及其与被水解的1,6-糖苷键的接近程度可能是LSB酶敏感性差异的原因之一。本研究为开发高产丁酸的新型益生元提供了理论依据。

Properties of butyrylated lotus seed starch with butyryl groups at differentcarbon positions

Xin Lia,b, Wei Chena,b, David Mahoudjro Bodjrenoua,b, Meihua Huanga, Yi Zhanga,b,c, Baodong Zhenga,b,*, Hongliang Zenga,b,c,*

aCollege of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

bFujian Provincial Key Laboratory of Quality Science and Processing Technology in Special Starch, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

cChina-Ireland International Cooperation Centre for Food Material Science and Structure Design, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, 350002, China

*Corresponding author.

E-mail address: zbdfst@163.com; zhlfst@fafu.edu.cn

Abstract

The objectives of this study were to investigate the properties of butyrylated lotus seed starch (LSB). LSB was prepared using an aqueous phase method and the substitution occurred at C2, C3, and C6. The surface of starch esters with high DS became rougher and more broken. Fourier transform infrared spectroscopy proved that the carbonyl group was successfully incorporated into the starch. The degree of crystallinity and molecular weight decreased as DS increased. Moreover, the thermal analysis and viscosity showed a lower gelatinization enthalpy and final viscosity of LSB compared with the unbutyrylated starch (LSB-0). The in vitro digestion characteristics showed that with different distributions at C2, C3, and C6, the content of resistant starch increased, indicating that LSB with higher DS had stronger resistance to digestion. This study revealed that the distribution of butyryl groups at different carbon positions was related to the properties.

Reference:

LI X, CHEN W, BODJRENOU D M, et al. Properties of butyrylated lotus seed starch with butyryl groups at different carbon positions[J]. Carbohydrate Polymers, 2022, 294: 119766. DOI:10.1016/j.carbpol.2022.119766.

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅