“最佳配方”可在体外诱导产生胚状体并实现子宫着床

撰文 | 言笑

哺乳动物胚胎的发生始于一个全能受精卵，逐渐发育成桑葚胚，然后形成囊胚（blastocyst）。囊胚的外胚层（epiblast,EPI）将发育为胚体和羊膜，滋养外胚层（trophectoderm,TE）和原始内胚层（primitive endoderm,PE）则分别发育为胎盘和卵黄囊。TE由滋养层细胞（trophoblasts,TRs）组成，是一种充满液体的上皮胞囊。EPI被不对称地放置在TE胞囊中，其位置定义了第一发育轴polar-mural，也称为embryonic-abembryonic（图1A）。紧邻EPI的TE（polar TE）增殖并自我更新，进而逐渐将胎盘构建成一个复合器官，履行关键功能（例如气体交换、废物排泄和免疫功能）；与EPI分离的TE（mural TE）与TE分化、增殖减少以及附着在子宫上的能力有关。因此，囊胚腔的一个功能是分离将形成胎盘或介导初始子宫附着的TRs库。为了应对囊胚植入，子宫细胞增殖并经历功能变化以产生蜕膜。蜕膜为胚胎植入、胎盘发育提供营养和免疫豁免，是子宫内膜基质细胞为适应妊娠而发生的形态学及生理学改变。错误的蜕膜化与不孕和流产有关【1】。

在囊胚中，滋养层细胞的模式化确保了成功的植入和胎盘发育。近日，来自奥地利科学院分子生物技术研究所的Nicolas C. Rivron团队在Cell Stem Cell杂志在线发表了题为Epiblast inducers capture mouse trophectoderm stem cells in vitro and pattern blastoids for implantation in utero的文章。研究人员鉴定了一组由外胚层分泌的最优诱导剂（FGF4、TGFβ1、IL11、Activin、Bmp7、LPA、8-Br cAMP），可在体外获得稳定、高度自我更新的类似于囊胚期的小鼠滋养外胚层干细胞（trophectoderm stem cells,TESCs）。TESCs具有更强的形成胚状体（Blastoids, 囊胚样结构）的能力，能在子宫内更有效地诱导蜕膜形成，进而促进胚胎着床。

为了探究TRs在不同位置、植入前后的区别，作者首先使用单细胞 mRNA 测序（scRNA-seq）数据【2】对E4.5 TE细胞进行分析，发现polar TE和mural TE转录组存在明显差异（图1）。Polar TE中调节TR自我更新的TFs（Cdx2、Esrrb和Elf5）、Wnt配体Wnt7b和BMP1/4/8b和受体Il6st增加；调节TR增殖的通路和基因上调，包括MAPK通路（Fgfr1、Mapk1、Map2k1、Grb2和Spry2）和增殖机器（Cdk1、Ccnb1-2、Ccnd1、Mki67和Pcna）；SMAD信号通路的效应子（E2f4、Smad3、Smad4和Smad7），以及调节Cdx2的Hippo通路成员（Amot、Lats2、Ywhab和Wwc1）和靶标（Max、Myc和Ccnd1）也上调。这些数据表明，STAT、SMAD和Hippo通路在polar TE中得到了增强。而Mural TE的特征包括与中间细丝（Krt8/18）和紧密连接（Ocln、Pard3和Pard6b/g）形成相关的分子以及转录因子Gata2、Klf4/5/9、Tfap2a和Tcf7l2。随后，作者比较了TE（E4.5）和ExE（extraembryonic ectoderm, 胚外外胚层，E6.5，植入后）TRs的转录组【3】，发现分泌配体Bmp4和Igf2的表达增加，而与胰岛素信号传导相关的基因表达减少。

图1. Polar TE与Mural TE细胞转录组差异分析

接下来，作者探究了滋养层干细胞（TR stem cells, TSCs）的异质性。通过对CDX2high（CDX2在晚期小鼠囊胚中标记polar TE）和CDX2low TSCs进行RNA-seq，鉴定了1941个差异表达基因。CDX2high TSCs中富集了调控自我更新的TFs（Esrrb、Eomes和Eif5）、细胞周期组分、Hippo通路和一些极性标志物（Ly6a和Ddah1）；相反，CDX2low TSCs高表达分化标志物Krt8和Gata2。通过scRNA-seq分析来描述TSC的异质性，显示TSCs存在三个亚群（cluaster3、4和5）：Cluster 4富集了TE相关基因，包括与上皮细胞相关的基因（Cldn4/6、Krt18、Epcam、Ctnna1、Lgals9、Krt8/18和Itga6）；Cluster 3富集了ExE基因（Eomes、Elf5、Hand1、Tead2、Id1、Cited2和Bmp4）；Cluster 5基本没有TE和ExE基因，反映了更多分化的TRs。因此，TSCs包含3个亚群：滋养外胚层、胚外外胚层和分化的滋养层。这些TSCs亚群反映了功能不同且可互换的干细胞状态：CDX2high细胞存在于细胞周期的所有阶段，而CDX2low细胞主要存在于G0/G1期；CDX2high细胞的致克隆率是CDX2low细胞的3倍，CDX2low细胞在去除FGF4/TGFb1后更容易分化；在CDX2high或CDX2low细胞分选后5天内，这些亚群重新建立了初始异质性。

进一步，作者通过检测EPI分泌因子在TSCs中诱导CDX2的能力，筛选到一组可诱导产生稳定的CDX2high TSCs的最优分子（EPI诱导剂）：FGF4（25 ng/mL）、TGFb1（2 ng/mL）、Activin（50 ng/mL）、IL11（50 ng/mL）、BMP7（25 ng/mL）、8-Br cAMP（200 nM）、LPA（5 nM）（简称 TXV）。在TXV中培养TSCs（1）增强了它们与 TE 的转录组相似性；（2）增强了自我更新；（3）抑制了与分化相关的基因表达；（4）保持了其快速分化和嵌合ExE的潜力；（5）具有增强的潜力来复刻TE上皮形态发生的特征。因此，作者将这些细胞称为滋养外胚层干细胞（trophectoderm stem cells, TESCs）。随后，作者发现EPI诱导剂可局部作用于TE polar-mural axis，TESCs具有更强的形成blastoids的能力。

最后，作者探究了EPI诱导剂与蜕膜形成之间的联系。在初始附着（~E4.5-5.0）之后，囊胚指示子宫形成蜕膜组织（~E5.0-7.5），但来自不同TRs库的贡献尚不清楚【4】。与TSCs相比，由TESCs或CDX2i-TSCs（CDX2诱导转基因-TSCs）形成的blastoids具有增强的蜕膜化能力，它们形成与囊胚大小相似的蜕膜，表明EPI诱导剂有助于TE进行蜕膜化。用GW501516（PPARd受体激动剂，赋予TE植入能力）处理blastoids，将降低CDX2表达及蜕膜化的可能性，表明CDX2表达赋予TR对子宫组织蜕膜化的能力。随后，作者试图鉴定（1）其分泌受CDX2调节的分子和（2）可能有助于蜕膜化的分子。通过SCENIC计算框架分析，预测了多个 Wnt 配体（Wnt6 和 Wnt7b）和受体（Fzd2/7/10），其启动子区域可能与CDX2结合。在囊胚中，Wnt7b转录本最丰富，其次是Wnt6。WNT7B在TE及其衍生物中高表达，Wnt6/7b表达在ExE中保持。由Wnt6或Wnt7b KO TESCs形成的blastoids最初附着在子宫上，与野生型相当（E5.5），但发育至E7.5时，蜕膜的大小显著减小。这些数据表明，EPI诱导剂不仅维持了局部TR增殖和自我更新，而且促进了WNT6/7B的分泌，刺激子宫蜕膜，有利于胚胎植入。

总的来说，该研究提供了一个框架来解释胎体如何利用诱导和 TR 状态波动来维持祖细胞、促进分化或分配和平衡植入发生所需的功能（图2）。作者表明EPI诱导剂的特定组合增加了TF网络（CDX2，EOMES和ESRRB）的最优性，增强了自我更新，并防止了分化。而对诱导剂的次优暴露有利于祖细胞状态的波动，从而产生具有促进分化的可逆亚群。这种EPI/TR界面的动态调节赋予祖细胞池一种灵活的策略，以维持更多的祖细胞或产生分化的细胞类型。该研究也存在一定的局限性：（1）由TESCs形成的胚层植入子宫并有效地形成了蜕膜，但并没有观察到胎儿的形成，尚未满足发育的最低要求；（2）基于TSCs中RNA-seq、ChIP、TESC和CDX2过表达分析，以及这些基因在人囊胚TE中的表达模式，选取了WNT6和WNT7b作为CDX2的下游效应子。然而，蜕膜化是一个涉及多个参与者的复杂过程，除了 WNT6/7b，胎体分泌的其他分子也可能会影响蜕膜化。

图2

https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.06.002

制版人：十一

参考文献

1. Cha, J., Sun, X., and Dey, S.K. (2012). Mechanisms of implantation: strategies for successful pregnancy.Nature Medicine18, 1754-1767.

2. Nakamura, T., Yabuta, Y., Okamoto, I., Aramaki, S., Yokobayashi, S., Kurimoto, K., Sekiguchi, K., Nakagawa, M., Yamamoto, T., and Saitou, M. (2015). SC3-seq: a method for highly parallel and quantitative measurement of single-cell gene expression.Nucleic Acids Research43, e60.

3. Posfai, E., Schell, J.P., Janiszewski, A., Rovic, I., Murray, A., Bradshaw, B., Yamakawa, T., Pardon, T., El Bakkali, M., Talon, I., et al. (2021). Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency.Nat. Cell Biol.23, 49-60.

4. Rivron, N.C., Frias-Aldeguer, J., Vrij, E.J., Boisset, J.C., Korving, J., Vivie, J., Truckenmuller, R.K., van Oudenaarden, A., van Blitterswijk, C.A., and Geijsen, N. (2018). Blastocyst-like structures generated solely from stem cells.Nature557, 106-111.

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