Nat. Chem.：用于超分辨成像的无“笼闭”基团的光激活染料的通用设计策略

导读

近日，德国Max Planck研究所Alexey N. Butkevich和Stefan W. Hell教授在设计无“笼闭”基团的光激活染料用于活细胞超分辨成像领域取得新进展，相关研究成果以“A general design of caging-group-free photoactivatable fluorophores for live-cell nanoscopy”为题发表在Nature Chemistry上。本文报道了一种将3,6-二氨基氧杂蒽酮转化为无“笼闭”基团的光激活染料的通用方法。所制备的光激活氧杂蒽酮类（photoactivatable xanthones, PaX）染料在光照射下可迅速组装为高亮度和稳定性好的派若宁（pyronine）染料。该策略还可以拓展到碳和硅桥连接的氧杂蒽酮类似物，得到覆盖可见光区的光激活染料体系。PaX染料还实现了对固定细胞和活细胞的传统共聚焦成像和超分辨成像（STED，PALM和MINFLUX）。

正文

荧光纳米显微成像技术由于非侵入性、特异性强、分辨率高（纳米级）等特点，被广泛用来观察生物样品的精细结构。化学特异性荧光探针和“开-关”型荧光探针则为该技术的核心。光激活染料和笼状染料在光的诱导下就可以发生可逆的荧光“开-关”转换，省去了特定的成像缓冲溶液以及高强度的紫外激发光，因而被广泛应用于单分子成像显微镜当中，如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重构显微镜（STORM）。罗丹明染料因具有性能可调、细胞膜通透性好、亮度高和光稳定性好的优点而备受青睐。然而，已报道得的罗丹明的“笼闭”策略是依赖于“锁住”染料分子使其不发光。一种是在氮原子上引入“光不稳定的保护基团”，另外一种是将内酯环转化为相应的环状α-重氮酮。前者会限制分子的取代方式，造成化合物水溶性变差、潜在的光毒性的问题，而后者会面临非荧光副产物的形成以及潜在有毒副产物等问题。因此，发展无“笼闭”基团、光激活效率高以及生物相容性好的荧光团用于荧光显微镜和纳米显微镜具有重要意义。本文中，作者合成了一系列功能化的氧杂蒽酮化合物，在单光子或者双光子激发下，分子会高效地转化为相应的二氢吡喃环派若宁染料。PaX染料通过三步合成即可被简易制备，该策略可扩展到碳和硅桥联的氧杂蒽酮类似物，得到一系列跨越大部分可见光谱的光激活荧光标签。其中，PaX衍生物硅-派若宁染料展现了良好的生物相容性和优异的光稳定性。最后，作者还成功地将PaX染料用于传统光学显微镜和超分辨显微镜的细胞成像当中。

作者利用光化学反应去组装或者“锁住”荧光团而不是“解锁”光不稳定的保护基团”的策略制备得到了新型笼状的罗丹明染料（Figure 1a）。通过在氧杂蒽酮骨架上引入合适的分子内自由基捕获基团，二芳基酮和自由基捕获基团（苯乙烯）通过光触发级联途径可以光组装为9-烷氧派若宁荧光团（Figure 1b）。为了研究自由基受体的取代作用，作者进一步合成了一系列光激活硅-派若宁染料（Figure 1c）。其中，化合物1-6在400 nm处具有较强的吸收峰。在光激活下，化合物1-6在质子溶剂中（如100 mM, pH=7的磷酸盐缓冲溶液）会经历快速且完全的化学结构变化，表现为明亮的发射（Figure 1d）。经实验测得，乙烯基取代的化合物1的光激活速率最慢，随着烯烃取代基团的增加，化合物4的速率最高，这可能是因为α-甲基取代基对烯烃的诱导作用（Figure 1e）。此外，作者还对进一步修饰的PaX染料化合物9-12进行了光激活速率的测试，化合物11的速率较高（Figure 1f），并得到其在一系列生理环境pH值下的光激活速率（Figure 1g）。最后，作者还测试了化合物11的光学稳定性，性能要优于商用染料（Figure 1h）。

Figure1.PaX染料的设计合成及表征（图片来源：Nat. Chem.）

接下来作者探究了上述化合物在生物成像中的应用（Figure 2）。通过在PaX560分子上偶联具有氨基反应活性的N-羟基丁二酰亚胺基团，可将其用于靶向色氨酸上的-NH2基团，因此得到了PaX260-NHS探针。并分别进行了STED和PALM超分辨成像。同时，在PaX560分子上偶联具有巯基反应活性的马来酰亚胺基团，得到的PaX480, PaX525 和PaX+560探针可用于靶向色氨酸中的-SH基团。对于固定细胞肌动蛋白的标记，在PaX560分子上偶联鬼笔环肽（phalloidin），制备的PaX260-phalloidin探针可实现对细胞的STED和PALM超分辨成像。

Figure2.光激活染料用于光学成像（图片来源：Nat. Chem.）

为了评估PaX染料用于活细胞成像的光激发机制，作者制备了分别带有线粒体和溶酶体靶向基团的染料PaX560-Mito和PaX560-Lyso（Figure 3a和b）。数据表明，在较高和较低的pH值条件下，两种染料都具有良好的细胞器靶向性和光激活特性。同时，作者还制备了Halo Tag特异性的氯烷烃衍生物（PaX560-Halo）和SNAP特异性的O6 -苄基鸟嘌呤衍生物（PaX560-SNAP），并得到了PaX560-Halo 标记的U2OS细胞中波形蛋白的双光子共聚焦图像以及STED图像（Figure 3c-f）。

此外，在405 nm激光的照射下，PaX560-Halo 和AL-560探针可实现在单个激发/检测通道下对U2OS细胞中的微管蛋白和波形蛋白的共聚焦多色成像（Figure 4a-e）。

Figure3.光激活PaX染料用于活细胞成像（图片来源：Nat. Chem.）

Figure4.PaX染料用于双通道成像（图片来源：Nat. Chem.）

另外，作者将化合物21和22用于活细胞SMLM成像当中（Figure 5）。所得到的图像均可显示明显的蛋白形貌，说明PaX染料可以进行有效的细胞标记和检测。最后，作者还将偶联抗体的化合物14成功用于对HeLa-Kyoto细胞的MINFLUX成像当中（Figure 6），平均标记精度可以达到3.7 nm。

Figure5.自标记PaX560底物对活细胞的PALM成像（图片来源：Nat. Chem.）

Figure6.PaX560底物对细胞的MINFLUX成像（图片来源：Nat. Chem.）

总结

德国Max Planck研究所Alexey N. Butkevich 和Stefan W. Hell 教授介绍了一种普适策略用来制备无“笼闭”基团、高亮度和生物相容性好的光激活染料。该系列染料可被应用在传统光学显微镜和超分辨显微镜（PALM、STED和MINFLUX）的光学成像当中。PaX染料的结构特点就在于光敏基团3,6-二氨基氧杂蒽酮结构与分子内的烯烃自由基捕获基团的结合，赋予了探针优异的细胞膜穿透特性。在单光子或者双光子激发下，染料会快速组装为高亮度和稳定性好的派若宁化合物。通过调控PaX染料上的取代基，还可以制备得到性能可调的染料从而用于多色成像当中。作者还证实了该系列染料可以作为不同靶向性能的荧光探针以及细胞超分辨成像探针。该研究成果促进了光激活染料在生物成像和材料科学领域的发展，对PaX染料的进一步优化也会为超分辨成像技术带来新的机遇。

文献详情：

Richard Lincoln , Mariano L. Bossi, Michael Remmel, Elisa D’Este, Alexey N. Butkevich*  and Stefan W. Hell *. A general design of caging-group-free photoactivatable fluorophores for live-cell nanoscopy. Nat. Chem. 2022. https://doi.org/10.1038/s41557-022-00995-0